淡水涡虫的眼点结构与形态发生过程分析,分子生物学论文

淡水涡虫的眼点结构与形态发生过程分析,分子生物学论文淡水涡虫从属于扁形动物门〔Platyhelminthes〕,涡虫纲〔Turbellaria〕,是动物界最早出现两侧对称、三胚层、营自由爬行生活的动物类群，在动物系统演化中占有重要地位。同时涡虫具有极强的再生能力，即便是小到虫体1279的涡虫组织也能够再生出一个完好的个体[1].当涡虫自耳突后切去头部后，1周内便能再生出完好的头部，包括功能正常的眼点[2].淡水涡虫由于其眼点构造简单，加上其独特的进化地位和极强的再生能力等特点，已成为研究视觉系统的构成、发育及再生的形式动物。1.淡水涡虫的眼点构造以淡水涡虫的重要代表---日本三角涡虫〔Dugesiajaponica〕为例，其视觉系统非常明显，一对眼点位于头部背侧两侧，仅由两类细胞构成：感光细胞和色素细胞，色素细胞构成半月形的视杯，感光细胞位于视杯外侧，其树突向前延伸到视杯内[3],轴突〔视神经纤维〕沿着身体背侧中部向后延伸，一部分在腹侧构成视觉中枢，一部分投射到身体对侧构成视穿插以整合双侧光感觉纤维传入的信息[4].另外，一些肌纤维伸入到视杯内，根据光线的强弱共同调节视杯开口处直径的大小，进而控制光的摄入量[5]〔图1A,1B〕.涡虫的眼点由于不含有晶状体等复杂的光折射系统，因而，其功能只能感遭到光强而不能成像。尽管如此，它们也和其他高等动物的眼一样，能吸收光能并转化成化学能再进一步转化成电能进而调节其生理活动。涡虫的眼点所具有的这些特征使得它接近于达尔文所提出的原始眼[6].它正在成为研究后生动物眼形态发生和进化的形式动物。2.涡虫眼点的形态发生经过在正常成体涡虫体内，其眼点细胞的更新是靠体内多能干细胞〔neoblasts〕的分化[8].利用免疫荧光染色技术对于涡虫视觉系统的形态发生经过研究发现，其再生经过可分为4个阶段：〔1〕自耳突切割后的第2天在背部两侧有成团的视觉细胞构成；〔2〕第3天两侧视神经细胞的轴突横向生长，穿过中线互相连接构成视穿插；〔3〕第5天另一部分视神经细胞向后纵向生长延伸至脑神经中枢的视觉中心；〔4〕第7天新构成的视神经细胞聚集构成轴突，构成完好的视觉系统[9]〔图2A,2B〕.3.涡虫眼点形态发生经过相关基因最近几年，借助先进的分子生物学技术，有关涡虫眼点形态发生经过中基因的表示出调控研究已获得了较大的进展。当前，在淡水涡虫中已克隆出了大量与视觉系统形态发生相关的调控因子并对其功能进行了研究〔表1〕,进而为研究涡虫视觉系统的构成和发育奠定了坚实的基础。3.1与眼点前体细胞分化相关的基因：当前发现，在涡虫眼点发育早期表示出的基因有Djsix-1、Djeya、Smednos、Smed-pbx、Smed-ovo和Smed-soxB主要与眼点前体细胞的分化密切相关。Djsix-1和Djeya分别属于Sineoculis/Six基因家族和Eya基因家族，两者均为比拟古老的保守基因。Djsix-1和Djeya在眼点构成的早期共表示出并且两者在涡虫眼点形态发生经过中协同作用，共同调控眼点的再生经过[10].通过RNA干扰技术〔RNAinterference,RNAi〕分别沉默两种基因，导致再生经过中均出现无眼类型。假如把Djeya和Djsix-1同时沉默，将发育成大量的无眼类型。而且，通过体外结合实验，也发现Djeya的保守区域ED和Djsix-1保守区域SD高度结合，据此揣测，Djeya和Djsix-1编码的调控蛋白通过构成严密结合的二聚体来促进眼点的构成和发育[10].通过实时定量PCR技术〔quantitativereal-timePCR,Real-timePCR〕发现，两种基因在涡虫眼点发育早期高表示出并且在再生的整个经过中表示出量都比拟高，因而以为两者不仅介入了眼点前体细胞的分化，而且在视觉系统功能恢复及维持其正常功能中发挥重要作用[11].当前，Djsix-1和Djeya已成为涡虫眼点形态发生早期标志性基因。最新研究显示，在果蝇眼的发育经过中，Eya不仅在感光细胞中表示出，还调控色素细胞的发育[12],但在涡虫眼点发育中尚未发现其对色素细胞的调控作用。Smednos基因属于Nanos基因家族，它调控具有锌指构造的NANOS蛋白，这种蛋白是高度保守的，其功能主要是促进生殖细胞的分化，同时，nanos基因也介入神经细胞的分化[13].Smednos基因在涡虫眼点的再生经过和胚胎发育经过中在正在分化的眼点细胞中表示出，但是眼点细胞分化完成后不再表示出，因而揣测Smednos基因可能在眼点前体细胞的分化经过中发挥作用[14].Smed-pbx基因是在地中海涡虫〔Schmidteamediterranea〕中鉴定出的一种编码包含PBC同源域〔包含PBX〕蛋白的基因，RNAi沉默该基因则涡虫不能再生出眼点，并且发现眼点前体细胞明显减少。因而以为Smed-pbx基因在涡虫眼点再生经过中对眼点前体细胞的构成是必需的[15].Lapan等[16]通过对涡虫眼点转录组的研究发现，一种保守的转录因子Ovo在涡虫眼点形态发生经过中发挥着与Six-1和Eya基因同等重要的作用。原位杂交实验表示清楚，在地中海涡虫〔S.mediterranea〕的眼点再生经过中，Smed-ovo基因在感光细胞和色素细胞中均表示出。头部切割后，Smed-ovo的表示出形式与眼点前体细胞的表示出形式类似，而且，几乎所有表示出Ovo基因的细胞同时表示出眼点前体细胞的标记基因Six-1/2和Eya.因而揣测，Ovo基因在眼点前体细胞中表示出，调控前体细胞的分化。RNAi沉默Smed-ovo导致再生经过中不能构成眼原基及眼点前体细胞。因而以为，Smed-ovo基因与Six-1和Eya基因一样，在眼点再生经过中发挥着至关重要的作用。同时还发现Smed-soxB在感光细胞和眼点前体细胞中均有表示出。在干扰Smed-soxB的涡虫中发现前部感光细胞明显减少，这表示清楚Smed-soxB基因可能具有促进感光细胞分化的功能。3.2与视神经纤维的生长相关基因：在眼点的发育经过中发现，与视神经纤维生长相关的基因主要有Otx、Djpax6、Djnetrin、Smed-netR、Djslit和Smed-roboA,它们主要在眼点形态发生的中期表示出。Otx基因家族是一个非常庞大的基因家族，其同源基因广泛存在于脊椎动物及无脊椎动物的视觉系统中[17~20].在淡水涡虫中，Djotx是第一个发现的与视觉系统相关的基因。固然Gtotx初次发如今淡水涡虫〔Girardiatigrina〕头部再生的胚基中强烈表示出，但对其在视觉系统中的功能并未具体阐述[21].随后，在日本三角涡虫〔D.japonica〕中发现了Otx基因的两个同源基因DjotxA和DjotxB,华而不实，DjotxB与Gtotx同源性比拟高。通过原位杂交发现两者主要在视神经细胞及视神经纤维部位表示出，因而推断两者与视神经纤维的生长及光传导作用相关[22].Pax6基因属于Pax基因家族，在很多脊椎动物和无脊椎动物中Pax6基因的表示出和视觉系统的发育密切相关，其突变体会导致眼的发育出现严重缺陷或无眼类型[23~25].因而，Pax6被视为动物视觉系统发育中的关键调控基因[26~28].然而，在淡水涡虫中，Pax6基因主要在成体的中枢神经系统〔centralnervoussystem,CNS〕中表示出，在再生的眼点中表示出水平很低，只能在超微水平检测到其表示出。并且，利用RNAi技术同时沉默Pax6A和Pax6B基因，再生的眼点未出现异常[5].利用Real-timePCR技术对涡虫眼点再生经过中Pax6基因的表示出情况进行检测。结果显示，Djpax6基因的表示出水平在涡虫头部再生的第5天到达峰值[11],而这个时期是视神经纤维向脑部延伸和眼点功能恢复期[29].因而以为，Djpax6基因可能与视神经纤维的生长有关，而在眼点发育的早期作用不大[11].Djnetrin属于Netrin基因家族，在高等动物中，主要是在体内血管构成经过中具有抗血管生成的作用[30,31].在日本三角涡虫中，Djnetrin在脑背侧中部视穿插部位表示出，因而以为它对视神经纤维向脑部延伸经过中具有诱导作用[32].在地中海涡虫〔S.mediterranea〕中发现两个Netrin基因的同源基因Smed-netrin1和Smed-netrin2,它们在成体和再生个体的CNS中均有表示出，并且在视中心部位也有表示出。通过RNAi同时沉默Smed-netrin1和Smed-netrin2,结果伸向视中心的视神经纤维变短。因而以为Smed-netrin1和Smed-netrin2在视神经纤维生长经过中起协同作用[29].另外，Real-timePCR结果显示，Djnetrin的表示出量在涡虫头部再生经过中逐步升高，且在切割后的第4天有一个明显调高[11],而切割后的第4天，也正是视神经纤维生长的时期[33].因而以为，在涡虫眼点再生经过中Djnetrin的作用主要是促进视神经纤维生长。Smed-netR〔netrinreceptor〕属于Netrin受体基因家族。在地中海涡虫中，RNAi沉默Smed-netR基因，不仅视神经纤维与脑部视中心的结合出现异常，而且，涡虫的避光反响也发生了改变。因而以为，Smed-netR基因是视神经纤维向脑部视觉中心正确结合经过所必需的，除此之外Smed-netR基因可能还介入了避光反响的调节[29].在日本三角涡虫中发现，Djslit和DjroboA基因与视神经穿插的正确构成有关，原位杂交结果显示Djslit在再生芽基的中心部位表示出。RNAi沉默Djslit基因，视神经穿插的构成出现异常；RNAi沉默DjroboA后，涡虫视神经穿插的构成也出现异常[9].同时在地中海涡虫中，RNAi沉默Smed-roboA基因同样会导致视神经纤维生长出现异常现象。因而以为这两个基因在涡虫眼点发育经过中具有指导视神经纤维正确生长的功能[34].3.3与视觉系统功能恢复相关的基因：在眼点形态发生后期表示出的基因主要有Eye53、1020HH和Opsin基因。Eye53和1020HH基因在日本三角涡虫再生的第5天表示出，RNAi沉默Eye53和1020HH基因后，固然没有观察到涡虫的大脑和视觉神经产生缺陷，但是涡虫却没有恢复避光反响的功能，因而以为Eye53和1020HH基因可能介入了视觉系统功能的恢复和维持[33].Inoue等[33]还指出，Eye53和1020HH基因编码分泌蛋白，这些分泌蛋白可能介入了视神经纤维的正确连接。Opsin基因所编码的视蛋白是动物视觉系统中最普遍的感光分子，与生色基团共价结合构成视色素，其功能是将光能转化成电能进而介导视觉构成。对水母〔Tripedaliacystophora〕的最新研究表示清楚，Opsin在其视觉系统中表示出，可能与光感受及图像的构成有关[35].在淡水涡虫中，Opsin主要在感光细胞胞体中表示出[10,36],RNAi沉默Gtops发现涡虫个体失去了避光反响的功能[36~38].同时Real-timePCR结果显示，在涡虫头部切割后Djopsin呈逐步上调表示出趋势，再生第5天明显升高，第14天到达最高值[11].这种表示出趋势和再生个体避光行为的恢复经过相对应，因而，进一步证实Djopsin基因在日本三角涡虫的眼点形态发生中的作用是恢复和维持个体的视功能。3.4与眼点视杯的构成相关的基因：有Sp6-9、Dlx、Smed-foxQ2、Smed-klf和Smed-meis基因。淡水涡虫的视杯主要是由色素细胞构成，其功能是感受光的方向并介入感光膜的生化反响[39].研究发现，Sp6-9和Dlx在再生涡虫的眼点色素细胞中表示出，尤其是在视杯前体细胞分化早期表示出。RNAi沉默这两种基因后导致再生经过中不能生成早期的视杯前体细胞，进而不能构成视杯。因而以为，Sp6-9和Dlx基因在涡虫再生经过中调控视杯的构成[40].同时，在对涡虫眼点转录组研究时发现，Smed-foxQ2、Smed-klf和Smed-meis基因分别在感光细胞和眼点前体细胞中表示出，RNAi沉默这3种基因发现视杯的形状均表现出异常，因而揣测，这3种基因可能与正常视杯的构成相关[16].4.结束语及瞻望毋庸置疑，涡虫由于其在动物系统演化中的特殊地位、惊人的再生能力和构造简单的原始眼,已成为研究后生动物眼的形