手性药物分析专家讲座

什么是手性药品(chiraldrugs)

药品分子结构中存在手性原因，而且由含有药理活性手性化合物组成药品，其中只含有效对映体或者以有效对映体为主。药品药理作用是经过与体内大分子之间严格手性识别和匹配而实现。手性药物分析专家讲座第1页手性药品药效学两种对映体含有相同或相近药理活性异丙嗪：抗组胺；普罗帕酮：抗心律失常。一个对映体含有药理活性，另一个活性弱或无活性

这类药品只有一个对映体与受体有较强亲和力，呈活性；另一个作用弱或无活性，为劣映体，这种劣映体相当于杂质。主要包含：非甾体抗炎药品α-芳基丙酸类化合物，如萘普生、布洛芬等。手性药物分析专家讲座第2页两种对映体药理活性相同，但反应强度不一样代表药品：抗癌药环磷酰胺，S-对映体活性是R-对映体2倍。

两种对映体含有不一样药理活性

这类药品经过作用于不一样靶器官、组织而展现不一样作用模式。代表药品：索他洛尔，S-对映体——β阻断作用

R-对映体——抗心律失常作用手性药物分析专家讲座第3页两种对映体作用相反这类药品对映体与受体都有一定亲和力，但通常只有一个对映体含有活性，另一对映体反而起拮抗剂作用。如：异丙肾上腺素（β1-受体激动剂）

R-(-)-：受体激动作用

S-(+)-：受体拮抗作用一个对映体含有药理活性，另一个含有毒性作用氯胺酮为中枢性麻醉药品，只有(S)-(+)-对映体才含有麻醉作用，而(R)-(-)-对映体则产生中枢兴奋作用。镇静药沙度利胺（反应停），(R)-对映体有镇静作用，(S)-对映体及其代谢产物有严重胚胎毒性和致畸作用。手性药物分析专家讲座第4页对映体作用互补性

如：多巴酚丁胺左旋体含有α-受体激动剂作用，对β-受体作用弱，而右旋体为β-受体激动剂，而对α-受体作用弱，所以外消旋体给药能增加心肌收缩力，但不增加心率和血压。不一样作用靶点表现不一样特征药品作用于不一样组织（靶点、受体）展现不一样特征，这类药品往往是多功效，作用是多方面。手性药物分析专家讲座第5页手性药品药代动力学吸收被动吸收：手性原因无影响。主动转运和易化扩散：可能发生对映体间竞争性相互作用和吸收改变分布

手性药品对映体竞争性与血浆蛋白、酶或受体结合，都可引发对映体间相互作用及其在分布上改变。手性药物分析专家讲座第6页代谢相互抑制作用：对映体竞争同一代谢酶，会发生对映体间相互抑制。单向抑制作用：假如一个对映体是另一个对映体代谢抑制剂，则会发生单向抑制作用。排泄

肾脏排泄立体选择性主要表现在肾小管分泌、主动转运和肾代谢过程，造成对映体间发生相互作用。手性药物分析专家讲座第7页

伴随对手性药品药理活性研究不停深入，人们已经认识并开始重视手性药品对映体生理作用和代谢过程差异。尤其是1992年美国食品与药品监督管理局（FDA）提出发展单一对映体生产计划和对映体药品纯度判定要求后，怎样能快速而准确分离和测定手性药品已成为医药界关注重大课题。手性药物分析专家讲座第8页手性药品拆分方法

利用物理性质——溶解度、吸附力等差异，如：结晶法、色谱法等；利用反应速度差异动力学拆分法；利用酶高度特异性催化反应酶拆分法色谱技术是当前手性药品分离主要方法手性药物分析专家讲座第9页手性药品分离惯用色谱技术高效液相色谱（HPLC）气相色谱（GC）高效毛细管电泳（HPCE）超临界流体色谱（SFC）手性药物分析专家讲座第10页手性液相色谱法（HPLC）间接法:手性衍生化试剂法（CDR）

首先将对映体经手性试剂衍生，生成非对映异构体后，利用常规HPLC方法分离测定。适于以下情况拆分：

不宜直接拆分化合物。添加一些基团，增加色谱系统选择性。如：手性脂肪胺类提升紫外或荧光检测效果。如：采取NBD-(L)-APY荧光试剂柱前衍生化测定布洛芬对映体，提升了检测灵敏度手性药物分析专家讲座第11页优点：*可采取通用非手性柱分离；*经过衍生化可提升检测灵敏度；*分离条件简单；*分离效果好。缺点：*要有可被衍生化基团；*要有高光学纯度手性试剂；*两个对映体衍生化速率和平衡常数应一致；*衍生化和色谱过程中不能发生消旋化。手性药物分析专家讲座第12页

对衍生化反应要求手性衍生化试剂含有高化学和光学纯度，且在贮存中不发生改变手性衍生化试剂和反应产物含有高稳定性衍生化反应过程中产物不发生消旋化现象待测手性药品含有易于衍生集团，如氨基、羟基、羧基等反应条件温和、快速、简便衍生化反应生成非对映体在色谱分离时应能显示高柱效手性药物分析专家讲座第13页惯用手性衍生化试剂

手性羧酸类

包含：酰氯、磺酰氯、酸酐和氯甲酸酯类。主要用于衍生手性醇、胺和氨基酸。可与化合物直接缩合，或与样品反应后，合成更有利于拆分与检测衍生物。手性胺类

主要用于羧酸、N-保护氨基酸、醇类等药品手性拆分。惯用试剂有：苯（萘、蒽）乙胺、二甲氨基萘乙胺、对硝基苯乙胺等。

异（硫）氰酸酯类

易于与大多数醇类及胺类化合物反应而被分离。

光学活性氨基酸类

广泛用于胺、羧酸及醇类药品，尤其是氨基酸类，其衍生化法基于肽合成原理。手性药物分析专家讲座第14页直接法

在分子间引入手性环境，即采取手性固定相或手性流动相不经柱前衍生化直接分离药品对映体1.手性固定相法（CSP）

连接在固定相上手性识别剂，与药品对映体反应形成非对映体复合物，然后作分离测定。分离程度和洗脱次序取决于复合物相对强度。2.手性流动相法（CMP）

向流动相中加入一手性试剂，它与溶质常以氢键、离子键或金属离子配位键生成非对映体缔合物，从而以常规HPLC固定相分离。3.手性检测器法（CD）手性液相色谱法（HPLC）手性药物分析专家讲座第15页优点★能广泛适合用于各类化合物，适于常规及生物样品分析测定；★除非必须衍生化，不然无需高光学纯度试剂；★样品处理步骤简单。★制备分离方便，定量分析可靠性较高；缺点★样品有时也须作柱前衍生（但不一定是手性衍生化试剂），★对样品结构有一定限制，其适用性尚不及普通HPLC固定相（包含正相和反相）那样广泛。★迄今为止，CSP柱商品已经有40各种，价格大多昂贵，还未有一个含有类似ODS柱普遍适用性。手性固定相法手性药物分析专家讲座第16页手性固定相类型：

刷型手性固定相手性聚合物固定相环糊精手性固定相大环抗生素手性固定相蛋白质手性固定相手性配体交换固定相冠醚手性固定相手性药物分析专家讲座第17页刷型手性固定相：

由一个光学纯R或S手性异构体与担体以共价结合而成。手性药品对映体与该手性固定相形成暂时性非对映体复合物，主要包含π-π作用、氢键作用和范德华力作用。大多使用非极性流动相，适合用于正相色谱分析。可拆分带有烷基、醚基或氨基取代π-给电子芳香化合物对映体，并能用于制备分离。优点：轻易制备，拆分选择性好，柱载量高，已经有各种商品化柱缺点：只适合用于含有芳香基团手性化合物分离。手性药物分析专家讲座第18页

手性聚合物固定相

包含纤维素衍生物型、合成聚合物型，主要经过吸引和包合作用实现对映异构体拆分。可分离烃、酯、醇、酸、酮、酰胺及含磷和硫化合物等。流动相：烷烃-醇混合体系（正己烷-异丙醇）手性聚合物固定相商品主要是日本Daicell企业制造chiralcel柱。其中chiralcelOD和chiralcelAD柱几乎能够满足常见85%手性化合物拆分，应用广泛。手性药物分析专家讲座第19页手性聚合物固定相Chiralcel柱类型与应用手性药物分析专家讲座第20页环糊精手性固定相：

α

-、β-和γ-环糊精（CD）是分别由6~8个葡萄糖单位经过α

-（1，4）连接组成环状低聚糖。CD-CSP经过共价键将CD键合到硅胶上，形成对水稳定键合相。

α

-

CD

：适合较小如含单苯基药品对映体分析γ-

CD

：适合用于较大分子药品分离，如甾体药品或含有稠环药品。β-

CD

：应用最广。对含有苯环、双环和多取代苯环手性药品能够实现良好拆分。如巴比妥类药品和麻黄碱等流动相：含水反相系统和非水有机系统均可影响分离原因：温度、pH、离子强度、流速手性药物分析专家讲座第21页

大环抗生素手性固定相

将包含多个手性中心大环抗生素固定到硅胶上形成了一类用于对映体拆分分析新型手性固定相。用于手性固定相制备大环抗生素有：万古霉素、替考拉宁、利福霉素和利托菌素A

。

手性药物分析专家讲座第22页蛋白质手性固定相：

以离子键（或共价键）和蛋白交联作用将蛋白质固定于硅胶上，利用蛋白质分子与手性化合物分子间立体选择性作用，进行药品对映体分离，其机理普通有氢键、静电作用、疏水作用、离子对和离子交换等作用。人α-酸性糖蛋白（α-AGP）：各种类型药品人血清白蛋白（HSA）：各种类型药品牛血清白蛋白（BSA）：适于阴离子型手性化合物，如氨基酸及其衍生物、芳香亚砜和香豆素类等卵黏蛋白（OVM）：用于胺类和羧酸化合物手性拆分纤维素二糖水解酶（CBH）：适于分离各种类型碱性药品。手性药物分析专家讲座第23页手性配体交换固定相

经过手性金属配合物与对映异构体作用形成非对映异构体金属配合物而进行手性拆分。主要用于α-氨基酸及其类似药品手性拆分。用于形成金属配合物离子均为过渡金属离子Cu(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Cd(Ⅱ）、Zn（Ⅱ）和Hg（Ⅱ）。商品配体交换柱有ChiralpakWH和WM等。手性药物分析专家讲座第24页冠醚手性固定相：

主要用于一些含有能够质子化伯胺官能团手性化合物分离，尤其是氨基酸及其衍生物对映体拆分。惯用冠醚是“18-冠-6”。普通使用酸性（如高氯酸）流动相。商品柱为日本Daicel企业CrownpakCR(+)或CR(-)柱。两柱手性拆分出峰次序相反，能够满足对映体纯度分析时不一样要求。冠醚类化合物有剧毒，有致癌性，试验时必须尤其注意。手性药物分析专家讲座第25页优点：使用常规色谱柱；无需手性试剂衍生；手性添加剂选择范围宽；可在柱后搜集到纯异构体缺点：手性添加剂消耗大；手性流动相添加法拆分方法建立较困难；系统平衡时间长；拆分制备时需分离手性添加剂手性流动相法手性药物分析专家讲座第26页惯用手性添加剂：

手性离子对试剂

在HPLC流动相中加入反离子，使之与流动相中对映体生成非对映离子对复合物，因为这些离子对复合物含有不一样稳定性和分配性质，在与固定相发生静电、疏水或氢键作用后，产生差速迁移而得以分离。可用于拆分氨基酸类、β-受体阻断剂、羧酸及磺酸类等化合物手性药物分析专家讲座第27页手性配体交换试剂

将手性金属配体交换剂加入HPLC流动相中，形成三元非对映体配合物，此配合物与固定相发生立体选择性吸引或排斥反应，因为其结构稳定性和能量差异，使对映体得以分离。惯用手性配体交换剂为氨基酸及其衍生物与金属离子（Cu、Zn、Ni、Cd等）配合物。可用于拆分氨基酸及其衍生物、β-受体阻断剂等手性药物分析专家讲座第28页

手性亲和试剂

含有天然手性性质蛋白质和胆酸盐可用作HPLC手性流动相法拆分对映体添加剂。可经过疏水性、静电、氢键和电荷转移等形成类非对映异构体而进行拆分。可拆分氨基酸、羧酸、胺类、巴比妥及β-受体阻断剂等。蛋白质手性添加剂还可用于药品-蛋白结合率测定。手性药物分析专家讲座第29页手性包合试剂

包含环糊精、环糊精衍生物和冠醚。主要利用包合作用在极性流动相中与对映体作用实现拆分。已用于分离氨基酸及其衍生物、巴比妥类、氯胺酮、苯妥英代谢物、美芬妥英及其代谢物、伪麻黄碱、去甲羟基安定、哌嗪类镇痛药等。手性药物分析专家讲座第30页手性氢键作用试剂

药品对映体经过与这类手性多羰基化合物分子间氢键作用形成非对映异构体而被拆分。（N-乙酰基-L-缬氨酸-四丁酰胺）拆分氨基酸及其衍生物和巴比妥类药品普通使用低级性流动相手性药物分析专家讲座第31页3.

手性检测器法（CD）

与紫外或示差折光检测器联用，将所用检测器前后再串联一个旋光检测器即可，使用双通道色谱数据处理机可同时得到两个检测器结果，经过计算机将两个对映体浓度直接计算出来。适合用于各类化合物，专属性好，无须与吸收波长相匹配，不须经手性分离，在手性药品测定上含有很大应用前景。手性药物分析专家讲座第32页手性气相色谱法（GC）

间接法（CDR）先经过共价结合作用，在对映体分子中引入另一个手性中心，形成非对映异构体后，再用常规GC方法拆分。对衍生化试剂要求试剂含有高化学和光学纯度试剂与对映体反应必须快速而且定量完成生成非对映体衍生物必须含有一定挥发性，以适合用于GC分析形成非对映异构体混合物须有足够大色谱行为差异形成非对映体衍生物须含有化学和立体化学稳定性手性药物分析专家讲座第33页惯用手性衍生化试剂

酰氯类

可拆分醇类、胺类薄荷醇酯和脲类可拆分醇类、酯类、胺类

异（硫）氰酸酯类

可拆分醇、酸类、糖醇类和其它

可拆分酸类、内酯类、樟脑、糖手性药物分析专家讲座第34页直接法（手性固定相法CSP

）

经过使用一个含有光学活性环境，即手性固定相，来提供拆分所需要手性中心。手性固定相类型：

基于氢键作用手性固定相，主要是氨基酸衍生物固定相基于配位作用手性固定相基于包合作用手性固定相，主要是各种环糊精衍生物手性固定相特点：

含有手性识别立体结构，即最少含有一个手性中心含有低熔点和高沸点，方便在较宽温度范围内使用含有良好可涂布性能，方便于GC柱制备手性药物分析专家讲座第35页基于氢键作用手性固定相：

主要为手性氨基酸衍生物和手性羧酸酯或酰胺聚合物。这类固定相中含有酰胺基或羧酸酯基，能够与手性药品分子中活泼基团经过氢键作用缔合，形成非对映异构体缔合物。因为立体原因和氢键作用不一样，所形成非对映异构体缔合物稳定性也不一样，造成对映体经过色谱柱所需时间不一样，从而实现对映体分离。对氨基酸、氨基醇对映体含有很好拆分性能。手性药物分析专家讲座第36页基于包合作用手性固定相：

主要为环糊精衍生物，能够用于各种类型易挥发性手性化合物拆分分析，是手性气相色谱首选固定相。键合环糊精手性柱商品有：Chirasil-Dex系列、Chirasil-Dex-TFA系列。手性药物分析专家讲座第37页基于配位作用手性固定相：

是由过渡金属离子和手性有机配体组成手性金属配合物。手性金属配合物固定相普通是一价或二价金属离子配合物。金属离子有铑(Rh)、铕(Eu)、镍(Ni)、锰(Mn)、钴(Co)、铜(Cu)和锌(Zn)等。手性配体主要是一些衍生萜烯酮，如樟脑酸、薄荷酸和香芹酮等。手性金属配合物固定相普通要求被分析物含有π电子或孤对电子，分离机制主要是基于π电子相互作用，偶极相互作用也存在。拆分对象主要为低沸点手性化合物，包含烯、醇、醚、酮、酯以及昆虫信息素、香精油等。

注：不能使用氢气做载气。氢气还原性会破坏手性金属配合物。手性药物分析专家讲座第38页高效毛细管电泳（HPCE）HPCE：

是以高压电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和/或分配系数不一样而实现分离优点：手性选择剂主要为直接加入，操作简单；手性选择剂消耗少，运行成本低；分离效率高；分离模式多样。分离模式毛细管区带电泳（CZE）

毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等速电泳（CITP）毛细管胶束电动色谱（MEKC）毛细管电色谱（CEC）手性药物分析专家讲座第39页毛细管区带电泳（CZE）

基于缓冲液中溶质各自电泳迁移速率不一样而进行分离

经过向背景电解质中添加手性选择剂方法实现离子型手性化合物拆分分离。应用最广泛。经过改变运行电解质溶液中手性选择剂类型和浓度，能够进行分离最优化。惯用手性选择剂：

CD及其衍生物冠醚手性金属配合物大环抗生素蛋白质和糖类手性药物分析专家讲座第40页毛细管凝胶电泳（CGE）

使用添加了手性选择剂凝胶为分离介质，基于被测组分质荷比和分子体积不一样而进行分离。惯用手性选择剂：

CD及其衍生物蛋白质类手性药物分析专家讲座第41页毛细管等速电泳（CITP）是一个不连续介质毛细管电泳技术，其基本原理是在毛细管电泳中到达平衡后，各区带相随，分成清楚界面以等速移动并完成份离。在CITP中，要使用两种缓冲液系统，其中一个为前导电解质，充满整个毛细管柱，另一个为尾随电解质，就是将手性选择剂作为前导电解质加入物，加入到缓冲液系统中进行手性拆分。惯用手性选择剂：

CD及其衍生物冠醚手性金属配合物大环抗生素蛋白质和糖类手性药物分析专家讲座第42页毛细管胶束电动电泳（MEKC）是在CZE缓冲液中加入表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超出临界胶束浓度时，表面活性剂分子之间疏水基团聚集在一起形成胶束-准固定相，溶质基于在水相和胶束相之间分配系数不一样而得到分离。当前最惯用是在十二烷基硫酸钠或胆酸盐胶束中加入CD来分离对映体。可拆分离子型和电中性手性化合物。手性药物分析专家讲座第43页毛细管电色谱（