高效液相色谱分析ppt

高效液相色谱分析ppt1第一页，共二十三页，2022年，8月28日基本概念与特点

概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段.特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。2第二页，共二十三页，2022年，8月28日液相色谱流程与原理基本原理：混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次分配过程，使得原来分配系数具有微小区别的各组分，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在柱中的移动速度不同，经过一定长度的色谱柱，彼此分离开来，最后按一定顺序流出。3第三页，共二十三页，2022年，8月28日色谱图及相关名词（一）色谱流出曲线—色谱图

色谱图是色谱柱流出物通过检测器所产生的响应信号对时间或液体流出体积的曲线。

色谱流出曲线是色谱基本参数的源流，而色谱基本参数又是用来观察色谱行为和研究色谱理论的重要指标。另外，还可以直接利用色谱图峰位置点（特征保留值）进行定性，根据曲线上测得的峰高或峰面积进行定量。4第四页，共二十三页，2022年，8月28日（二）柱效能

色谱柱在色谱分离中由动力学因素所决定的柱效能，通常用塔板高度或塔板数表示。塔板数：

塔板高度：涡流扩散相分子扩散相流动相线速度传质阻力相5第五页，共二十三页，2022年，8月28日（三）分离度R分离度的表达式：tR(2),tR(1):组分2和组分1的保留时间Wb(2),Wb(1):组分2和组分1的峰底宽度6第六页，共二十三页，2022年，8月28日R=1.5完全分离7第七页，共二十三页，2022年，8月28日

高效液相色谱系统（一）高效液相色谱仪结构流程高压泵色谱柱废液检测器进样器储液瓶高压输液泵、高效分离柱、高灵敏度检测器8第八页，共二十三页，2022年，8月28日（二）高压输液系统（高压泵）

高压输液泵是核心部件，要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。

高压泵主要有恒流泵（往复泵）和恒压泵（气动泵）两种。恒流泵特点输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关。分为机械注射泵和机械往复泵(常用)两种。恒压泵特点能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。

9第九页，共二十三页，2022年，8月28日电动机偏心轮柱塞柱球形单向阀溶剂图10-7柱塞往复泵示意图10第十页，共二十三页，2022年，8月28日（三）色谱柱

色谱柱是高效液相色谱分离过程的核心。一支稳定、高效的色谱柱对建立适用性强、重现性好的分析方法是必不可少的。

1.担体

高效液相色谱的柱填料有离子交换树脂、凝胶，较多的使用硅胶微粒作为担体。以下为几种常用的微粒类型：

(1)全多孔型担体：属于颗粒均匀的多孔球体，很好的兼顾了效能、样品荷载量、耐久性等理想的性质，所以最为常用。(2)表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：

它是直径为30～40μm的实心核(玻璃微珠)，优点是：孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易于填充均匀，柱效高。这种担体目前应用较为普遍。11第十一页，共二十三页，2022年，8月28日2.色谱柱

柱体为直型不锈钢管，标准内经为4.6或3.9mm，柱长15～30cm，填料颗粒粒度5－10μm。发展趋势是减小填料粒度(3－5μm)和柱经以提高柱效。

为保护色谱柱，通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。

12第十二页，共二十三页，2022年，8月28日3.固定相选择固定相的一般标准还是以“相似相容”原理为基础。如果溶质溶于烃类溶剂，表明是低极性化合物，这样就可以选择非极性或亚极性固定相。若样品溶于极性温和溶剂中，如醇类，则可选择极性固定相，也可以选择非极性固定相。13第十三页，共二十三页，2022年，8月28日4.流动相

液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况，改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离度的有效手段。常用溶剂：环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水等。14第十四页，共二十三页，2022年，8月28日正相液相色谱（正相柱）固定相极性>流动相极性反相液相色谱（反相柱）固定相极性<流动相极性组分极性越大，保留时间越长；使用极性化合物的分离。组分极性越小，保留时间越长；适用非极性化合物的分离。15第十五页，共二十三页，2022年，8月28日

选择流动相时应注意的问题1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。16第十六页，共二十三页，2022年，8月28日3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。17第十七页，共二十三页，2022年，8月28日（四）检测器（一）、紫外检测器—应用最广泛的检测器基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯-比耳定律。优点：灵敏度高，线形范围宽；死体积小；波长可选；对流速和温度变化不敏感；可用于梯度洗脱。缺点：无紫外-可见吸收组分不响应；流动相选择受一定限制。18第十八页，共二十三页，2022年，8月28日(a)可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器19第十九页，共二十三页，2022年，8月28日（二）、示差折光检测器—通用型检测器每种物质具有不同的折光指数。基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。

生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。

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缺点：灵敏度低；对温度敏感；不能用于梯度洗脱。21第二十一页，共二十三页，2022年，8月28日（三）、荧光检测器—专用型检测器基本原理：在一定的条