2020-2021高中生物3配套学案：专题一第二节基因工程的基本操作程序含解析

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精2020-2021学年高中生物人教版选修3配套学案：专题一第二节基因工程的基本操作程序含解析第二节基因工程的基本操作程序学习目标课程标准1．了解目的基因获取的常见方法.2．理解基因表达载体的构建是基因工程的核心。（重、难点）3．掌握将目的基因导入受体细胞的方法.（重点）4．理解目的基因的检测与鉴定。1．简述基因工程的原理及技术。2．观看基因工程的影像资料。基础知识·双基夯实基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:①__目的基因的获取__、②__基因表达载体的构建__、③__将目的基因导入受体细胞__、④__目的基因的检测与鉴定__。一、目的基因的获取1．从基因文库中获取目的基因：将含有某种生物⑤__不同基因__的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的⑥__不同基因__,称为基因文库.基因文库可大可小,如果它包含了一种生物所有的基因，就叫⑦__基因组文库__;如果它只包含一种生物的一部分基因，就叫⑧__部分基因文库__，如⑨__cDNA文库__。2．从基因文库中获取目的基因的具体方法：可根据基因的⑩__核苷酸__序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA以及基因的表达产物⑪__蛋白质__等特性来获取目的基因.3．利用PCR技术扩增目的基因：PCR技术是一项在生物体外⑫__复制__特定DNA片段的核酸合成技术。（1)原理：利用⑬__DNA双链复制__原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其呈指数方式增加.指数扩增约为2n(n为扩增循环的次数）.(2)条件:已知目的基因的一段⑭__核苷酸__序列以便合成⑮__引物__、⑯__模板DNA__、⑰__热稳定DNA聚合酶（或Taq酶）__。（3)过程：目的基因DNA受热变性后解链为⑱__单链__，与引物结合，然后在⑲__热稳定DNA聚合酶（或Taq酶)__的作用下进行延伸形成DNA。4．人工合成法：⑳__基因__比较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。二、基因表达载体的构建(基因工程的核心)1．目的：eq\o\ac(○，21）__是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用__.2．组成：目的基因(符合人们需要的，编码蛋白质的eq\o\ac(○,22)__结构基因__)、eq\o\ac（○，23）__启动子__（是一段有特殊结构的eq\o\ac（○,24）__DNA片段__，位于基因的首端,是eq\o\ac（○，25）__RNA聚合酶__识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的eq\o\ac(○，26）__蛋白质__)、终止子、标记基因（作用：eq\o\ac（○,27)__为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来__,常用的标记基因是eq\o\ac（○,28)__抗生素抗性基因__等）。三、将目的基因导入受体细胞1．将目的基因导入植物细胞一般采用的方法是eq\o\ac(○,29）__农杆菌转化法__。其中,转化是指目的基因进入eq\o\ac（○,30）__Ti质粒的T－DNA__→农杆菌→导入植物细胞→稳定维持和eq\o\ac(○,31)__表达__.另外两种方法还有eq\o\ac（○，32)__基因枪法__和eq\o\ac(○，33）__花粉管通道法__.2．将目的基因导入动物细胞一般采用的方法是eq\o\ac（○，34）__显微注射技术__。3．将目的基因导入微生物细胞，是因为原核生物具有的特点是eq\o\ac(○，35)__繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等__。最常用的转化方法是用eq\o\ac(○,36)__钙离子__处理细胞→感受态细胞→eq\o\ac（○,37)__重组表达载体__与感受态细胞混合→感受态细胞吸收eq\o\ac（○，38)__DNA分子__。四、目的基因的检测与鉴定1．分子检测（1)首先检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了eq\o\ac(○，39)__目的基因__，可用eq\o\ac（○,40）__DNA分子杂交技术__；(2)其次检测目的基因是否eq\o\ac（○,41）__转录出mRNA__,可用eq\o\ac(○,42）__分子杂交技术__;(3）最后检测目的基因是否eq\o\ac(○,43）__翻译成蛋白质__，可用eq\o\ac（○，44)__抗原—抗体杂交法__。2．个体生物学水平鉴定：如做抗虫或抗病接种实验.思考1．为什么要用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA分子？提示：目的是产生相同的黏性末端，便于两者完全拼接.2．用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？提示：导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子.3．植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？提示：植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体,因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制,因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。┃┃活学巧练__■判断题1．所有的目的基因都可以从基因文库中获取.(×)分析：基因文库包括部分基因文库(如cDNA文库)和基因组文库，前者含有某生物的部分基因，不可能从其中获得全部目的基因，后者包含该生物的所有基因，可以获取所有目的基因。2．基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。(√）3．基因文库也称为基因库.（×)分析：某种生物所含有的全部基因称为该种生物的基因库，而基因文库是通过微生物来储存的某种生物的基因。4．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA连接酶.（×）分析：Taq酶是热稳定DNA聚合酶，是连接单个脱氧核苷酸的,不是DNA连接酶。5．PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。(√）6．基因表达载体中含有启动子和密码子。（×)分析：基因表达载体的构建是基因工程的核心，基因表达载体包括启动子、终止子、标记基因和目的基因。密码子是位于信使RNA上的相邻的三个碱基.7．水稻植株受到损伤时,伤口处细胞会分泌酚类化合物，吸引农杆菌,引起植株感染。（×)分析：农杆菌主要感染双子叶植物和裸子植物，而水稻是单子叶植物。8．农杆菌感染植物的机理:Ti质粒上的T－DNA可转移到植物受伤细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起.(√)9．检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因，这是检测目的基因是否发挥功能作用的第一步。(×）分析:基因的功能之一是表达，即转录和翻译，检测目的基因是否转录出mRNA,是检测目的基因是否发挥表达功能的第一步。10．目的基因的检测和鉴定过程中，分子水平的检测方法都是DNA分子杂交技术。(×)分析：检测是否转录出mRNA利用的是分子杂交技术(是DNA探针与mRNA的杂交），检测是否翻译出相应的蛋白质，利用的是抗原一抗体杂交技术。11．基因工程的四个步骤中都涉及碱基互补配对原则.(×)分析:第三步“将目的基因导入受体细胞”中没有涉及碱基互补配对原则.课内探究·名师点津知识点目的基因的获取┃┃重难拓展__■目的基因的获取概括地说主要有两条途径：①可以从自然界中已有的物种中分离出来②可以用人工的方法合成1．从基因文库中获取目的基因：基因文库的构建实际上就遵循基因工程的基本操作程序。做法是:将某种生物体内的DNA全部提取出来,选用适当的限制性核酸内切酶,将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来,导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都包含了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，构成了这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。cDNA文库与基因文库的区别可具体参阅教材中的“生物技术资料卡”.2．利用PCR技术扩增目的基因：PCR技术是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加.利用PCR技术获取目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解旋为单链,引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次.上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。3．人工合成目的基因：人工合成目的基因的方法主要有两种。（1）反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。(2）化学合成法：即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。知识贴士由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段,不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的方法.┃┃典例评析__■典例1目的基因的分离是基因工程研究中的主要方面和操作关键.下面甲、乙图表示从真核生物细胞中获取目的基因的两种方法，请回答下列问题.（1)在甲图中，a过程是在__限制性核酸内切__酶的作用下完成的。如果用该类酶中的一种，不一定能获取目的基因,其原因是__一种限制性核酸内切酶只能对特定的碱基序列进行切割，此序列若在目的基因内部，则不能得到目的基因__。(2）在乙图中，c过程在遗传学上称为__转录__，d过程称为__逆转录__，d过程需以mRNA为模板，__脱氧核苷酸__为原料,还需要的条件是ATP、__逆转录酶__、DNA聚合酶等。(3)除了上述两种方法可以获取目的基因外，请你再写出一种方法：__根据已知蛋白质中的氨基酸序列，可以推知基因的脱氧核苷酸序列,再进行化学合成__。解析：获取目的基因的方法较多,甲是通过限制酶获取目的基因，但由于切割位点可能在基因内部，故可能得不到想要的目的基因；乙是通过信使RNA逆转录形成DNA(目的基因)的过程;此外，还可通过蛋白质中氨基酸的排列顺序推测基因的脱氧核苷酸序列,再进行化学合成。┃┃变式训练__■1．下列获取目的基因的方法中需要模板链的是（D）①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④ B．①②③C．②③④ D．②③解析：PCR利用的是DNA双链复制原理。即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板.反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA,再合成双链的DNA。①④则均不需要模板。知识点基因表达载体的构建┃┃重难拓展__■基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心.1．构建目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用.2．表达载体的组成：启动子＋目的基因＋终止子＋标记基因＋复制原点。（1)目的基因——外源DNA分子的有效片段。（2)启动子——一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶的识别和结合部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。(3)终止子——位于基因的尾端,也是一段有特殊结构的DNA短片段。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录到此终止。(4）标记基因—-鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因.（5)复制原点—-DNA复制的起点,带动目的基因复制.3．目的基因与载体的结合:将目的基因与载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒为载体，将目的基因与质粒结合的步骤是：(1)用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。（2）用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端.（3)将切下的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。如下图：4．差异性:由于受体细胞有动物、植物、微生物之分，加之目的基因导入受体细胞的方法不同，所以表达载体的构建也会有差异性。知识贴士切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶.如果两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。┃┃典例评析__■典例2下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ识别序列及切割位点↓GGATCCCCTAGG↑↓AAGCTTTTCGAA↑↓GAATTCCTTAAG↑↓CCCGGGGGGCCC↑（1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后,分别含有__0、2__个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的SmaⅠ酶切位点越多，质粒的热稳定性越__高__.(3）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是__SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因、外源DNA中的目的基因__。（4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止__质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化__。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合,并加入__DNA连接__酶.（6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了__鉴别和筛选含有目的基因的细胞__.解析:（1）切割前质粒为环状，不含游离的磷酸基团.切割后质粒成了一个链状的双链DNA分子，含两个游离的磷酸基团。(2)因为SmaⅠ识别序列中均为G—C碱基对，G、C之间含三个氢键，热稳定性高。(3)据题图可知,SmaⅠ既会破坏标记基因，也会破坏目的基因。(4)若用同种限制性内切酶切割质粒和外源DNA中的目的基因，因为两端的黏性末端能够互补配对，会出现自身环化的情况。而用两种限制酶切割，因为两端形成的黏性末端不能够互补配对，不会出现自身环化。(5)DNA连接酶可以连接具有能够互补配对黏性末端的DNA片段。(6）标记基因可以鉴别受体细胞是否含有目的基因。┃┃变式训练__■2．下列关于基因表达载体的构建描述错误的是（D)A．基因表达载体的构建是基因工程的核心B．基因表达载体的构建包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分C．目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因D．构建的基因表达载体都是相同的解析：基因表达载体的构建是基因工程的第二步,也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因；由于受体细胞不同,基因表达载体的构建也会有差别,不可能都是相同的.知识点将目的基因导入受体细胞┃┃重难拓展__■将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化.将目的基因导入受体细胞的方法很多，应具体情况具体分析。不同受体细胞导入方法不同。生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射法Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→农杆菌→导入植物细胞→融合到受体细胞的DNA→表达目的基因表达载体构建→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子知识贴士①农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有感染力。此外，将目的基因导入植物细胞还可采用基因枪法和花粉管通道法.②以上介绍的几种方法，在导入受体细胞之前，都必须进行目的基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子,而不能直接导入目的基因.┃┃典例评析__■典例3采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是（C）①将毒素蛋白注射到棉受精卵中②将编码毒素蛋白的DNA序列,注射到棉受精卵中③将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞,再进行组织培养④将编码毒素蛋白的DNA序列,与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵A．①② B．②③C．③④ D．①④解析：考查基因工程的操作步骤。基因工程的操作步骤是:目的基因的获取→基因表达载体的构建→目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。本题着重考查基因工程步骤中的第三步:目的基因必须与细菌质粒重组，形成基因表达载体,方可导入棉受精卵中。┃┃变式训练__■3．下列关于目的基因导入微生物细胞的叙述中，不正确的是（D)A．常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞、遗传物质相对较少B．受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态C．感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度D．感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液解析：由于原核生物繁殖快，且多为单细胞、遗传物质相对较少等特点，所以早期的基因工程通常用原核生物作为受体细胞；受体细胞经Ca2＋处理后,处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，称为感受态;感受态细胞吸收DNA分子需要在适宜的温度和酸碱度的缓冲液中完成。知识点目的基因的检测与鉴定┃┃重难拓展__■目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其中遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作,也是检查基因工程是否做成功的一步。目的基因的检测内容和方法的比较如下表：类型步骤检测内容方法结果显示分子检测第一步目的基因是否进入受体细胞DNA分子杂交（DNA和DNA之间）是否成功显示出杂交带第二步目的基因是否转录出mRNA分子杂交技术(DNA和mRNA之间)同上第三步目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交同上个体水平鉴定包括：做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同知识贴士①目的基因在受体细胞中的存在与表达是有区别的。目的基因被受体细胞摄取是表达的前提,但是被摄取并不意味着被表达。由于各种因素的影响，有时还需要采取一定的措施去促使目的基因的表达。②DNA探针的应用所依据的原理是DNA分子杂交。DNA分子杂交是指DNA片段在适合的条件下能和与之互补的另一个片段结合.如果对最初的DNA片段进行标记,即成为探针。也就是说,探针都是放射性同位素等标记的含有目的基因的DNA片段.┃┃典例评析__■典例4目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是(C)①检测受体细胞是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录④检测目的基因是否翻译成蛋白质A．①②③ B．②③④C．①③④ D．①②④解析：本题考查目的基因的检测与鉴定.目的基因的检测首先要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,方法是用DNA分子杂交技术,使DNA探针与基因组DNA杂交；其次检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是用基因探针与mRNA杂交；最后检测目的基因是否翻译成了蛋白质,方法是用抗原—抗体杂交。┃┃变式训练__■4．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是（D）A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白解析：eq\x(\a\al(目的基因，表达的依据））→eq\x（\a\al(得到相应，的蛋白质））→eq\x(D项正确)eq\b\lc\\rc\］（\a\vs4\al\co1(\x（A、C项）→\x(\a\al（完成目的，基因的导入）),\x（B项）→\x（\a\al（完成目的，基因的转录))））→eq\x（都未完成表达）指点迷津·拨云见日一、易混淆概念辨析1．基因、基因文库、目的基因（1)基因是有遗传效应的DNA片段,是控制性状的遗传物质的基本结构和功能单位，基因的脱氧核苷酸序列代表遗传信息.(2）基因文库是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过克隆而储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，叫做基因文库.建立基因文库的目的就是为获得大量的目的基因做准备.如果基因文库中含有一种生物的所有基因，这个基因文库就叫做基因组文库。如果基因文库中含有一种生物的部分基因，这个基因文库就叫做部分基因文库。基因文库就相当于某种生物的基因仓库，储备着大量的同种基因.(3）目的基因是基因工程操作中需要的外源基因,它是编码某种蛋白质的结构基因,如生物的抗逆性基因、抗虫基因等。2．DNA复制、PCR技术与基因克隆（1）DNA复制与PCR技术的比较DNA复制PCR技术场所细胞核内生物体外原理碱基互补配对DNA双链复制酶DNA聚合酶、解旋酶热稳定DNA聚合酶(Taq酶）条件模板、dNTP、引物链、常温模板、dNTP、引物链、温度变化（90℃~95℃→55℃~60℃→70℃～75原料四种脱氧核苷酸dNTP特点形成的是整个DNA分子，一个细胞周期只复制一次短时间内形成大量目的基因DNA片段(2)基因克隆:用多种限制性核酸内切酶或者机械的方法，将某种生物细胞中的DNA切成不同片段，并把所有片段随机地分别连接到用同种限制酶切过的基因运载体上，然后分别转移到适当受体细胞，如细菌中.通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系.二、提取目的基因方法的比较途径从基因文库中直接分离目的基因人工合成基因（真核细胞)方法鸟枪法反转录法根据已知氨基酸序列合成DNA过程供体细胞中的DNA↓限制酶许多DNA片段↓连接质粒载体↓导入受体细菌↓外源DNA扩增，产生特定性状↓分离目的基因目的基因mRNA↓反转录单链DNA↓合成双链DNA（即目的基因)蛋白质的氨基酸序列↓推测mRNA的核苷酸序列↓推测结构基因的核苷酸序列↓化学合成目的基因优点操作简单专一性强专一性强，可产生自然界不存在的新基因缺点工作量大，盲目性大，专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高适用范围狭小典例5水稻种子中70％的磷以植酸形式存在。植酸易同铁、钙等金属离子或蛋白质结合排出体外,是多种动物的抗营养因子；同时，排出的大量磷进入水体易引起水华。为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻,培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程.据图回答：(1）图中基因组文库__大于__（小于/等于/大于)cDNA文库。(2）B过程需要的酶是__逆转录酶__;A、C过程中__可以__(可以/不可以）使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。(3)目的基因Ⅰ和Ⅱ除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中__DNA__和__cDNA__为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是__耐高温__.解析：由于mRNA是以DNA一条链为模板转录出来的，所以A、C可以使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。核心素养·技能培优案例棉铃虫是一种危害棉花的害虫。我国科学工作者发现一种生活在棉铃虫消化道内的苏云金芽孢杆菌能分泌一种毒蛋白使棉铃虫死亡，而这种毒蛋白对人畜无害。通过基因工程方法,科学家采用花粉管通道法将毒蛋白基因转入棉花植株并成功表达，棉铃虫吃了这种转基因棉花的植株后就会死亡。花粉管通道法是指利用植物花粉萌发时形成的花粉管通道将毒蛋白基因送入胚囊，进而导入尚不具备细胞壁的合子或早期胚细胞，最终形成含有目的基因的种胚。此种方法的优点是操作简便，省去了组织培养的复杂过程。（1）利用花粉管通道法将毒蛋白基因导入棉花细胞，此过程是基因工程操作的基本步骤中的第三步，即__将目的基因导入受体细胞__.此前一步要把目的基因整合到Ti质粒的T－DNA上，原因是__Ti质粒能将目的基因整合到棉花染色体的DNA上__。如果我们已知毒蛋白的氨基酸序列，可以采用__化学法人工合成目的基因__的方法获取毒蛋白基因。(2）基因工程的工具酶可以将目的基因切下并连接到载体上。限制酶可以识别特定的DNA序列，并切断磷酸二酯键。以限制酶识别的序列是6个核苷酸组成为例，那么下列所示的黏性末端是由__4__种这样的限制酶作用产生的。它们能被DNA连接酶连接在一起形成__2__个DNA片段。(3)用标记的特异性抗体可以直接检测毒蛋白，这种检测方法称为__抗原-抗体杂交__。也可在宏观性状水平检测该目的基因是否表达，方法是__让害虫吃棉花,观察害虫的生存状态__。（4)已知转基因植物中毒蛋白只结合某些昆虫肠上皮细胞表面的特异性受体，使细胞膜穿孔，肠细胞裂解，昆虫死亡.而该毒蛋白对人类的风险相对较小，原因是人类肠上皮细胞__细胞膜表面无特异性受体__。探规寻律解答基因工程基本操作程序题目的一般步骤——三辨、三找、一析、一理（1)三辨：分辨限制酶的种类及识别序列和切割位点。在切割目的基因和载体时，一般用同一种限制酶切割,也可用不同的限制酶切割，但两种限制酶切割后产生的黏性末端中碱基要互补配对。（2)三找：找出标记基因、目的基因及其插入位点。一般来说，质粒中至少有一个标记基因,如抗生素抗性基因。明确目的基因的插入位点是在标记基因内部还是在标记基因之外。（3）一析：分析目的基因插入质粒后是否破坏了标记基因。如果质粒中有一个标记基因,插入后一般不破坏标记基因；如果质粒中有两个标记基因，则需看标记基因中是否有插入位点，如果某一标记基因中有插入位点，则目的基因插入质粒后该标记基因被破坏.(4)一理：理清判断目的基因是否导入受体细胞的思路。一般用含有某种抗生素的培养基培养受体菌,如果有两种抗生素抗性基因,还需判断用哪一种抗生素来检测。问题释疑·探究升华教材P15思考与探究1．作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？提示:不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，需使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达.如通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中，此目的基因无法进行转录；(2)目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；(3)为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（4）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位,往往要加上可以标识存在部位的基因(或做成目的基因与标识基因的融合基因）,如绿色荧光蛋白基因等.2．根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物(如小麦)，从理论上说，你认为应该怎样做？提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌,在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计,约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感.裸子植物对该菌也敏感.当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来,也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力.根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L－阿拉伯糖、D－木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区)基因的诱导物，使Vir区基因活化,导致T－DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞.需要注意的是，农杆菌中不同的菌株侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的；对于单子叶植物不同的种类，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物;②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性)和激活农杆菌的Vir区（诱导性)的基因，使T－DNA转移并插入到染色体DNA上。3．利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下,若要生产人的糖蛋白,可以用大肠杆菌吗？提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此,在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的.4．β－珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时,动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β－珠蛋白，想一想，应如何进行设计？提示：基本操作如下：(1)从小鼠中克隆出β—珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。（2)将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。(3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉;如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β－珠蛋白基因已进入其中。(4）培养进入了β－珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β－珠蛋白。教材P8求异思维你能推测出由mRN