快速检验课件基因芯片技术

基因芯片技术

Genechiptechnology基因芯片技术2第一节基因芯片简介基因芯片的概念基因芯片的工作原理基因芯片分类特点基因芯片的基本构造

基因芯片技术31.基因芯片的概念芯片有基因芯片和蛋白质芯片两类。基因芯片（Genechip）又称DNA芯片、DNA阵列(DNAmicroarray)、cDNA芯片(DNAchip)、寡核苷酸阵列等。是在基因探针的基础上研制出的；它将大量探针分子（cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段）固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析，从而迅速得出所要的信息。

基因芯片技术4蛋白质芯片主要是检测各种生物毒素的，制备芯片的原料就是常见的所有可能的致病菌(甚至包括其不同种、菌株)所分泌的特定毒素的单抗。基因芯片技术5基因芯片包括二种模式：*一是将靶DNA固定于支持物上，适合于大量不同靶DNA的分析。如对食品致病菌的快速检测鉴定。

二是将大量探针分子固定于支持物上，适合于对同一靶DNA进行不同探针序列的分析。基因芯片技术6基因芯片结构图Affimetrix公司制作的DNA芯片基因芯片技术72．基因芯片的工作原理基因芯片（GeneChip）工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern、northern)一致，应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。

基因芯片技术8

基因芯片技术9基因芯片技术103.基因芯片分类基因芯片总体上可分为三种主要类型：1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。这种方法的优点是所需检测设备与目前分子生物学所用的放射显影技术相一致,相对比较成熟。但芯片上探针密度不高，样品和试剂的需求量大，定量检测存在较多问题。

基因芯片技术112）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。

基因芯片技术123）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。基因芯片技术13

3.1基因芯片按用途可以分为:

表达谱芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片、测序芯片、毒理芯片基因芯片技术143.2基因芯片按其材质和功能可分为

元件型微阵列芯片通道型微阵列芯片生物传感芯片

毛细管电泳芯片PCR扩增芯片集成DNA分析芯片毛细管电层析芯片光学纤维阵列芯片白光干涉谱传感器芯片生物电子芯片凝胶元件微阵列芯片药物控制芯片基因芯片技术153.3按基因芯片点阵的制备方法可分为3.3.1原位合成适用于寡核苷酸。根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。有两种途径：①光刻法：可合成30nt左右，每步缩合率较低为95％左右，产率仅20％，需要特殊的合成试剂。②压电打印法：可合成50nt左右，每步缩合率为99％以上，产率可达74％，不需要特殊的合成试剂。核苷酸nucleotide

基因芯片技术163.3.2直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。将合成好的探针、cDNA、基因组通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。

优点：方法较原位合成简单，定量准确，重现性好，使用寿命长。

缺点：喷印的斑点大，探针密度低。基因芯片技术173.4按基因芯片的支持物，可分为：薄膜型：如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。玻片型：这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，点阵密度很高，所以必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。

微板型：一种具有高密度、小容量测试孔的小型酶联免疫检测板。

基因芯片技术18集成电路型：将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的地通过电子装置检测或控制DNA等生物大分子的作用过程。基因芯片技术194、基因芯片技术的特点其中关键就是基因芯片具有微型化、集约化和标准化的特点，从而有可能实现“将整个实验室缩微到一片芯片上”的愿望。“高通量性”尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。基因芯片技术20第二节基因芯片的制作基因芯片(DNA芯片)技术主要包括四个主要步骤：芯片制作、样品制备与标记、分子杂交、信号检测与结果分析基因芯片技术21DNA芯片的制作原理

基因芯片技术221．芯片的制作

要成功的制作芯片，需要准备3大材料：准备固定在芯片上的生物分子样品、芯片片基和制作芯片的仪器。分两步:1.1.支持物的预处理1.2.制备方法基因芯片技术231.1支持物的预处理1.1.1对载体材料要求：①载体表面必须具有可以进行化学反应的活性基团，以便与生物分子进行偶联。②使单位载体上结合的生物分子达到最佳容量。③载体应当是惰性的和有足够的稳定性，包括机械的、物理的和化学的稳定性。基因芯片技术241.1.2支持物的预处理实性材料：硅芯片、玻片和瓷片,需进行预处理,使其表面衍生出羟基、氨基活性基团。膜性材料：聚丙烯膜、尼龙膜、硝酸纤维膜,通常包被氨基硅烷或多聚赖氨酸。基因芯片技术25基因芯片技术261.2制备方法

芯片种类较多，制备方法也不尽相同，但常用的基本上可分为两大类：一类是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸；一类是预合成后直接点样多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。基因芯片技术27原位合成有两种途径：一是光刻法（Affymerix公司专利技术），可以合成30nt左右，打印法可以合成40-50nt，每步缩合率较低，一般为95%左右，合成30nt产率仅20%；一是压电打印法，每步缩合率可达99%以上,合成30nt产率可达74%，从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。基因芯片技术281.2.1原位光刻合成寡聚核苷酸采用的原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。基因芯片技术29光导原位合成法制作基因芯片的步骤基因芯片技术30光导原位合成法制作基因芯片(图)

基因芯片技术311.2.2原位压电打印法

(Piezoelectricprinting)

芯片压电打印法合成原理与普通的彩色喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等合成试剂。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。基因芯片技术321.2.3点样法

点样法与原位合成法比较较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。基因芯片技术33

点样法是将合成好的探针、或PCR技术扩增cDNA或基因组DNA经纯化、定量分析后通过阵列复制器（arrayingandreplicatingdeviceARD）或阵列点样机（arrayer）及电脑控制的机器人，准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上，再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。基因芯片技术34点样的方式分两种：接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上；非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。宣坚刚.基因芯片.ppt基因芯片技术35基因芯片技术36基因芯片技术37基因芯片技术382.样品制备与标记样品制备待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。制备方法：体外转录、PCR、逆转录等。基因芯片技术39样品标记待测样品的标记，主要采用荧光分子。常规标记通过在扩增过程中加入含有荧光标记的dNTP，荧光标记的单核苷酸分子，在转录和复制过程中，被引入新合成的DNA片段。后者变性后，即可与基因芯片上的微探针阵列进行分子杂交。也可采用末端标记法，直接在引物上标记荧光。即在引物合成时通过应用荧光标记的dNTP制备荧光标记引物，或通过标记生物素，进行荧光标记。基因芯片技术40对于阵列密度较小的基因芯片可以用同位素检测法，采用32P标记技术。高密度芯片的分析一般采用荧光素标记探针，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。基因芯片技术41新标记方法——多色荧光标记技术，可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的探针用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱，常用的双色荧光试剂有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光技术可大大提高芯片的准确性和检测范围。基因芯片技术42基因芯片技术433．杂交反应杂交反应是指标记的样品与芯片上的靶基因进行杂交，产生检测信号的过程。基因芯片与探针的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同，但杂交时间短，30分钟内完成，可同时平行检测许多基因序列。基因芯片技术44杂交反应条件的选择合适的杂交条件可使生物分子间的反应处于最佳状态，增强其检测的灵敏度，减少错配率，提高信噪比。杂交反应的条件要根据靶基因或探针的长度、标记元素种类及芯片的类型来优化。基因芯片技术45基因芯片技术46基因芯片技术47基因芯片技术484.信号检测与结果分析检测原理芯片经杂交反应后，各反应点形成强弱不同的光信号图像，待测样品与芯片上探针阵列杂交后，荧光标记的样品结合在芯片的特定位置上，形成强弱不同的光信号图像，未杂交分子被除去，用激光扫描仪或激光共聚焦显微镜采集各杂交点的荧光信号如荧光位置、荧光强度;再用相关软件进行图像分析和数据处理，并与探针阵列的位点进行比较，即可得出待测样品的信息。基因芯片技术49检测方法用同位素标记靶基因，信号检测即是放射自显影；用荧光标记，信号检测即是荧光扫描及分析系统。图像的分析可用落射荧光显微镜(EpifluorescenceMicro-scope)、电荷偶联装置照相机(Charge-coupledDeviceCamera)、共聚焦激光扫描仪(ConfocallaserScanner)等进行。基因芯片技术50信号检测与结果分析示意图

基因芯片技术51基因芯片技术52基因芯片的特点DNA芯片的突出优点在于：①强大的类比性。使得以往需多次处理的遗传分析在同一时间和条件下快速完成。②巨大的信息产出率。在一张芯片上不仅可以获得组织、细胞、血液等基因表达信号的定性、定量分析，还可实现全局检测静态到动态、时间与空间上的差异及遗传信息。③高度敏感性和专一性。能可靠并准确检测出10pg/μl的DNA样品。基因芯片技术53④高度重复性。一张由尼龙膜制作的微阵列，可以重复杂交使用多达20次。⑤微型化和自动化。现已出现的芯片面积最大不过525cm２，最小仅有1cm２；每个阵列中阵点样品DNA的用量仅为5nl左右；试剂用量和反应体积大大减少，反应效率却成百倍提高。⑥哺育新的实验方法。此技术易与其它常规生物技术相融合交叉。基因芯片技术54第三节基因芯片基本应用1.基因表达分析2.基因型及多态性分析3.杂交测序4.疾病的诊断与治疗5.药物研究与开发6.基因功能研究7.在营养与食品卫生领域的应用8.在环境科学领域中的应用9.农业和畜牧业10.军事和司法11.在转基因食品检测中的应用12.在食品微生物检测中的应用基因芯片技术551.基因表达分析基因表达谱芯片应用最为广泛，技术上也最成熟。可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述。基因芯片技术562.基因型及多态性分析利用结合在玻璃支持物上的等位基因特异性寡核苷酸(ASOs)微阵列建立了简单快速的基因多态性分析方法。将ASOs共价固定于玻璃载片上，采用PCR扩增基因组DNA，其一条引物用荧光素标记，另一条引物用生物素标记，分离两条互补的DNA链，将荧光素标记DNA链与微阵列杂交，通过荧光扫描检测杂交模式，即可测定PCR产物存在的多种多态性，该方法对人的酪氨酸酶基因第4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析，结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。基因芯片技术573.杂交测序基因芯片的测序原理是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，可以用图来说明。

基因芯片技术58基因芯片测序流程基因芯片技术594.疾病的诊断与治疗基因芯片在寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达、感染性疾病、遗传性疾病和肿瘤等疾病的临床诊断方面具有独特的优势。与传统检测方法相比，它可以在一张芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测；无需机体免疫应答反应，能及早诊断，待测样品用量小；能检测病原微生物的耐药性，病原微生物的亚型；极高的灵敏度和可靠性；检测成本低，自动化程度高，利于大规模推广应用。这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。基因芯片技术605.药物研究与开发基因芯片技术具有高通量、大规模、平行性等特点可以进行新药的筛选，尤其对我国传统的中药有效成分进行筛选。目前，国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了基因芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用，用芯片作大规模的筛选研究可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，在基因组药学（pharmacogenomics）领域带动新药的研究和开发。基因芯片技术616.基因功能研究在基因组学和后基因组学研究中，基因芯片也起到重要的作用。应用基因芯片可以开展DNA测序、基因表达检测、基因突变性、基因功能研究、寻找新基因、单核苷酸多态性（SNP）测定等研究。与传统的Northernblot杂交或点杂交方法相比，基因芯片技术具有大规模平行处理的能力。基因芯片技术62基因芯片突变检测原理示意基因芯片技术637.在营养与食品卫生领域的应用采用基因芯片技术研究营养素与蛋白和基因表达的关系，将为揭示肥胖的发生机制及预防打下基础。还可用于营养与肿瘤相关基因表达的研究，如癌基因、抑癌基因的表达与突变，营养与心脑血管疾病关系的分子水平研究。再者，食品营养成分的分析、食品中有毒、有害成分的分析和检测等。基因芯片技术648.在环境科学领域中的应用在环境保护上，基因芯片也广泛的用途，一方面可以快速检测污染微生物或有机化合物对环境、人体、动植物的污染和危害，同时也能够通过大规模的筛选寻找保护基因，制备防治危害的基因工程药品、或能够治理污染源的基因产品。基因芯片技术659.农业和畜牧业利用基因芯片技术，对有重要经济价值的农作物和水果等的基因组进行大规模高通量的研究，筛选农作物的基因突变，并寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的相关基因，以开发高技术含量、高附加值的新产品。也可利用基因芯片技术筛选、开发高效低毒的生物农药。基因芯片技术6610.军事和司法美国以有部分公司得到政府的资助开发生物战病原体检测系统。在司法领域，国外的公司正在开发便携式DNA芯片检测装置，它可以直接在犯罪现场对可能是疑犯留下来的头发、唾液、血液、精液等进行分析，并立刻与DNA罪犯指纹库系统存储的DNA“指纹”进行比较，以尽快、准确的破案。我国上海的司法部司法鉴定科学技术研究所第一个“罪犯DNA数据库”在99年9月7日通过了专家鉴定，利用DNA破案将成为一种重要的破案手段。另外，基因芯片还可作亲子鉴定等