发酵工程实验

发酵工程实验第1页/共69页实验一、斜面培养基的选择一、实验目的学习菌种斜面培养基选择的方法和原理。二、实验原理良好的斜面培养基能使孢子迅速萌发和生长，菌丝生长快、产生孢子多、孢子产生时间短，从而获得优质的种子液，并缩短发酵的周期。根据菌株在斜面培养基上菌丝生长和孢子产生速度、数量和质量等情况，来选择适当的斜面培养基。第2页/共69页三、实验材料菌株：一株链霉菌。培养基成分：葡萄糖、L-天门冬酰胺、K2HPO4、微量盐、琼脂、酵母膏、燕麦片、复合维生素、麦芽膏、马铃薯。其他仪器设备和材料：试管、移量管、灭菌锅、接种环、无菌培养皿、恒温培养箱、超净工作台、酒精灯、无菌水等。第3页/共69页四、实验步骤1．培养基配制和灭菌：1#：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.6。2#培养基：酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏5g，复合维生素3.5mg，微量盐1ml，琼脂20g，定容至1L，pH7.2；第4页/共69页3#培养基：燕麦片20g（煮沸30分钟，8层纱布过滤），微量盐1ml，琼脂20g，定容至1L，pH7.2；4#：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.6。采用湿热灭菌，灭菌温度为121℃，时间30min。第5页/共69页2．培养基灭菌及试管斜面制作。3．斜面接种：用接种环取配制好的链霉菌孢子悬液一环，在长度一样的斜面上分别涂布接种，28°C恒温箱内培养。4．菌丝形态和孢子产生观察：每24h观察菌丝生长和孢子产生情况，第3d开始每天取一支斜面加入5ml无菌水，振荡均匀，用移量管从试管中取0.1ml涂布在平板上，28°C下培养，3d后观察并记录菌落数。第6页/共69页五、注意事项1．试管采用同一规格，培养基装量一致，斜面长度一致，以免影响结果。2．斜面接种量用同一接种环，以确保接种量一致。3．整个过程在无菌操作下完成。六、实验结果及分析对实验所观察到的现象、实验结果进行分析，选择该菌株的斜面培养基。七、思考题斜面培养基必须满足什么条件？不同菌株的斜面培养基是否相同？为什么？如何设计斜面培养基？第7页/共69页实验一具体安排1、斜面接种后第三天（星期六）每组每天分配2人进行取样，检测斜面生长情况和孢子的产生情况。（大家最好把时间安排好，共用移液管）0.1ml孢子悬液涂布培养计数第8页/共69页2、记录连续三天计数结果，确定生长好、产生孢子数量多的斜面培养基第9页/共69页实验报告的写法题目：一株链霉菌斜面培养基的选择1材料与方法1.1材料1.2方法2结果与分析3讨论第10页/共69页实验二、种子培养基的选择一、实验目的学习发酵生产种子培养基选择的方法和原理。二、实验原理种子培养基主要是为菌丝的生长繁殖提供营养，所以应保证其营养成分易被菌体吸收利用，通常是以菌体生长速度和菌体浓度来选择种子培养基。第11页/共69页在一定时间内，菌丝体生长快则生长量大，生长量大菌体密度就大。在一定范围内，菌体密度越大，其吸光度就越大，根据吸光度的大小可以初步检测其菌体密度，进一步确定种子液的生长情况。一定体积的种子液其菌体湿重或干重大，则其生长量大，根据菌丝体湿重或干重的大小就可以确定种子液的生长情况，从而确定适当的种子培养基。第12页/共69页三、实验材料菌种：实验一保存的生长良好的斜面。培养基成分：酵母膏，葡萄糖，麦芽膏，复合维生素，微量盐，淀粉，牛肉膏，蛋白胨，CaCO3等。其他仪器设备和材料：分光光度计，移量管，灭菌锅，接种环，无菌培养皿，恒温培养箱，超净工作台，酒精灯，三角瓶，纱布，无菌水等。第13页/共69页四、实验步骤1．培养基配制及灭菌：1#培养基：酵母膏4g，葡萄糖4g，麦芽膏10g，复合维生素3.5mg，微量盐1ml，定容至1L，pH7.2。2#培养基：淀粉24g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏5g，蛋白胨3g，CaCO34g，定容至1L，pH7.0。500ml三角瓶装液体种子培养基100ml，8层纱布封口。采用湿热灭菌，灭菌温度为121℃，时间30min。第14页/共69页2．孢子悬液的制备：取2支生长良好的斜面菌种，各注入5ml无菌水，充分振荡，将孢子从斜面上洗脱，倒入无菌三角瓶备用。3．接种及培养：用移量管取4ml孢子悬液，接入待选择的种子培养基中，置于28℃、180rpm的摇床上进行培养。第15页/共69页4．菌丝体生长状况观察：1d后每12h取样检测。每次取样10ml，先进行吸光度的检测（分光光度计用未接种的种子培养基进行调零），再全部倒入预先干燥称重的滤纸内进行过滤，用无菌水洗涤菌体3次，除去水溶性杂质，称重，记录菌丝体湿重，用放入60℃电热鼓风干燥箱中进行干燥至恒重，称重，记录菌丝体干重。第16页/共69页五、注意事项1．孢子悬液制备和种子液的取样都要进行严格的无菌操作，防止杂菌污染。2．注意要充分洗去水溶性的杂质，以免影响实验结果。3．干燥时间要适宜。六、实验结果及分析对实验所观察到的现象、实验结果进行分析，选择该菌株的种子培养基。第17页/共69页七、思考题1．为什么湿重法和干重法要充分洗去水溶性成份？2．菌丝体干燥时间为什么不能太短、也不能太长？3．如何选择种子培养基？第18页/共69页取样离心读取菌体体积过滤洗涤称湿重烘干称干重第19页/共69页第20页/共69页第21页/共69页实验三、发酵培养基的选择一、实验目的初步了解不同发酵培养基对发酵终产物和目的产物的影响，理解发酵培养基成分对目的产物及其发酵产物提纯的重要性。二、实验原理在不同的发酵培养基条件下，微生物进行初级代谢的途径基本一致，初级代谢产物也大体相同，但是其次级代谢途径则可能有很大不同，因此产生的次级代谢产物成分可能也大不相同，在一定溶剂系统下展开，不同次级代谢产物在TLC上的Rf值不一样，利用TLC检测，可以初步确定其不同发酵培养基产生的不同次级代谢产物。第22页/共69页三、实验材料菌种：摇瓶培养48h一株链霉菌的种子液。培养基成分：甘露醇，大豆粉，葡萄糖，酵母膏，淀粉，蛋白胨，NaCl，K2HP4，MgSO47H2O，CaCO3。其他材料、设备仪器：灭菌锅，恒温振荡培养箱，超净工作台，酒精灯，三角瓶，茴香醛显色剂等。第23页/共69页四、实验步骤1．培养基配制与灭菌1#：甘露醇20g，大豆粉20g，定容至1L，pH7.0；2#：大豆粉20g，葡萄糖20g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP40.5g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8（定容测pH后，再将CaCO3在加入培养基内）；培养基配制完后，加入150ml的三角瓶中，每瓶状液量为40ml，用湿热灭菌，灭菌温度为121℃，时间30min。第24页/共69页2．接种与培养：将生长良好的种子液按15%的接种量进行接种，接完种后置于28℃、180rpm的摇床上进行培养，培养时间为6d。3．发酵产物初步提取：发酵结束后，将发酵液进行超声破壁30min，加入乙酸乙酯30ml，100rpm摇床振荡20min，再用滤纸滤去菌丝体，滤液用分液漏斗将乙酸乙酯相分离出来，进行减压浓缩至4~5ml液体。第25页/共69页4．TLC（薄层层析）检测：在同一块薄层层析硅胶板上将浓缩液在进行点样，再利用适当的展层溶剂进行展层。待溶剂前沿到达硅胶板另一端时取出硅胶板，溶剂完全干后将硅胶板置于紫外仪下检测，记录检测结果，取出硅胶板进行显色反应，并记录显色结果。五、注意事项1．点样时注意点不宜太大，其直径不超过0.5cm，最好0.2~0.3cm。2．点样量要足够多，使展层后能够检测出更多的不同条带。第26页/共69页六、实验结果及分析记录TLC检测的结果（紫外检测和显色结果），说明对于一定目的产物来说，发酵培养基成分的重要性。七、思考题1．同一微生物菌株在不同培养基上所产生的次级代谢产物相同吗？请简要分析其原因。2．用TLC检测微生物菌株不同代谢产物时，这些产物必须满足什么条件？第27页/共69页第28页/共69页实验四、目的产物发酵效价的TLC检测一、实验目的初步学习发酵过程中TLC检测目的产物效价的方法；了解目的产物产量随发酵时间而变化的的关系。第29页/共69页二、实验原理微生物产生的抗生素一般都是次级代谢产物，微生物生长从对数生长期进入稳定期时才产生次级代谢产物。那些对一定波长的光具吸收的次级代谢产物，可以利用TLC展层后刮板的方法，将相应条带刮下，用溶剂浸泡，再利用分光光度计进行检测浸泡液的吸光度，根据吸光度的大小，即可初步确定目的产物的发酵效价。第30页/共69页三、实验材料菌种：摇瓶培养48h一株链霉菌的种子液。培养基成分：大米，大豆粉，米糠。其他材料、设备仪器：乙酸乙酯等有机试剂、灭菌锅，超净工作台，酒精灯，三角瓶，紫外分光光度计，层析缸等。第31页/共69页四、实验步骤1．培养基的配制与灭菌：大米50g，大豆粉30g，米糠20g，H2O100mL，装入500mL三角瓶；采用高压蒸汽灭菌，温度121℃，时间60min，灭完菌后趁热将培养基振散。2．接种：将生长良好的种子液接入固体发酵培养基中，每瓶接种量为25ml。接完种后置于28℃恒温培养箱内进行静置培养。第32页/共69页3．取样检测：24h后进行取样，取样时间间隔为24h，每次取样2g左右，取出的样品先进行称重，再按一定比例加入有机溶剂提取其中目的组分，减压浓缩至少量溶剂，进行TLC检测，刮取目的组分的条带，按样品重量比例加入相应体积的溶剂，取上清液进行紫外吸收检测。4．根据吸光度，计算目的组分的发酵效价。第33页/共69页五、注意事项1．取样时注意严格的无菌操作，以免杂菌污染。2．刮取目的组分条带时，不要将无关组分刮下，也不能将目的组分漏刮，否则结果误差较大；浸泡目的组分的TLC条带时所用溶剂的量要根据所取的样品重量。六、实验结果及分析记录实验结果，分析原因及其说明的问题。第34页/共69页七、思考题为什么微生物次级代谢产物产量会随着时间而发生变化？有时当目的产物发酵效价达到最大值以后，如果继续发酵目的组分产率非但不增加，反而越来越少，甚至完全消失，试解释其原因。第35页/共69页第36页/共69页实验五、变温发酵对目的产物产量的影响一、实验目的初步了解不同温度对菌体生长和抗生素发酵效价的影响，理解变温发酵对提高目的产物的意义。第37页/共69页二、实验原理微生物在发酵过程中，首先要进行菌丝体的生长，对于分批发酵或实验室三角瓶发酵来说，随着营养物质的消耗、其他有害因素的积累，其生长由对数期进入稳定期，菌丝体生长量达到最大，此时微生物便通过次级代谢途径，迅速将初级代谢产物转变为次级代谢产物。对于许多微生物产生的抗生素来说，此时发酵温度适度降低，将大大提高目的产物的产量。第38页/共69页三、实验材料菌种：摇瓶培养48h一株链霉菌的种子液。培养基成分：大米，大豆粉，米糠。其他材料、设备仪器：乙酸乙酯等有机试剂、灭菌锅，超净工作台，酒精灯，三角瓶，紫外分光光度计，层析缸等。第39页/共69页四、实验步骤1．培养基的配制与灭菌：大米20g，大豆粉5g，米糠7g，H2O30mL，装入150mL三角瓶；采用高压蒸汽灭菌，温度121℃，时间60min，灭完菌后趁热将培养基振散。2．接种：将生长良好的种子液接入固体发酵培养基中，每瓶接种量为10ml。3．变温培养：接完种后置于28℃恒温培养箱内进行静置培养，当菌丝体长满固体培养基时，将温度下调3℃继续培养，对照组仍然采用28℃。在菌丝体出现溶菌时终止发酵。第40页/共69页4．目的组分提取：将发酵物加入乙酸乙酯50ml超声破壁30min，再置于100rpm摇床上振荡30min，用滤纸过滤，滤液用分液漏斗将乙酸乙酯相取出，进行减压浓缩，浓缩液加乙酸乙酯进行定容。5．发酵效价检测：取0.2ml样品溶液，进行划线点样，待样品干后进行展层，将目的组分条带刮下，用一定体积溶剂浸泡，取上清液进行吸光度检测。6．根据吸光度，计算两个样品中的目的组分的发酵效价。第41页/共69页五、注意事项变温时间要选择好，在菌丝体生长量未达到最大之前变温可能会影响菌丝体的生长速度。选择的制备型硅胶板制板条要一致，以免影响结果。如浓度太高，则先要进行稀释，再检测吸光度。六、实验结果及分析记录实验结果，分析原因及其说明的问题。七、思考题为什么抗生素工业发酵采用变温发酵？对于某些抗生素而言，变温发酵为什么产量会有所提高？第42页/共69页第43页/共69页实验六、葡萄糖浓度对目的产物发酵效价的影响一、实验目的初步了解不同浓度的葡萄糖对抗生素发酵效价的影响，进一步理解优先利用的速效碳源分解代谢产物的抑制作用。第44页/共69页二、实验原理在有易于利用的碳源存在的条件下，细胞不会生产异化难利用碳源的酶。这种控制机制使细胞以更为经济的方式去合成蛋白质，从而加强它在自然界生存竞争的优势。许多抗生素的合成过程受葡萄糖的抑制。葡萄糖引起的抑制作用并不是葡萄糖本身的直接作用，而是葡萄糖作为一种易被利用碳源，促进了抗生素产生菌生长的结果，而抗生素的产率与菌体生长速率大致成反比，因此葡萄糖等速效碳源过多的情况下，微生物产生的抗生素产量往往降低。第45页/共69页三、实验材料菌种：摇瓶培养48h一株链霉菌的种子液。培养基成分：大豆粉，葡萄糖，酵母膏，淀粉，蛋白胨，NaCl，K2HP4，MgSO47H2O，CaCO3。其他材料、设备仪器：灭菌锅，恒温振荡培养箱，超净工作台，酒精灯，三角瓶等。第46页/共69页四、实验步骤1．培养基配制与灭菌1#：大豆粉20g，葡萄糖20g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP40.5g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8（定容测pH后，再将CaCO3在加入培养基内）；2#：大豆粉20g，葡萄糖40g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP40.5g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8。培养基配制完后，加入150ml的三角瓶中，每瓶状液量为40ml，用湿热灭菌，灭菌温度为121℃，时间30min。第47页/共69页2．接种与培养：将生长良好的种子液按15%的接种量进行接种，接完种后置于28℃、180rpm的摇床上进行培养，培养时间为5d，另外剩下一瓶2#培养基发酵7d。3．发酵产物初步提取：发酵结束后，将发酵液进行超声破壁30min，加入乙酸乙酯30ml，100rpm摇床振荡20min，再用滤纸滤去菌丝体，滤液用分液漏斗将乙酸乙酯相分离出来，进行减压浓缩至4~5ml液体。第48页/共69页4．TLC（薄层层析）检测：三个样品各取0.2ml，在制备型薄层层析硅胶板上进行划线点样，再利用适当的展层溶剂进行展层。展完层后待硅胶板上的溶剂完全挥发干再进行紫外检测，将目的条带刮下，以同样体积的溶剂浸泡样品，取浸泡液上清部分进行吸光度检测，如果浓度太高，则稀释后再检测。5．记录检测到的吸光度，计算目的组分的发酵效价。第49页/共69页五、注意事项选择的制备型硅胶板制板条要一致，以免影响结果。如浓度太高，则先要进行稀释，再检测吸光度。六、实验结果及分析记录实验结果，分析其原因及其说明的问题。七、思考题为什么工业发酵抗生素要限制速效碳源、氮源的使用？如何才能做到既要保证适量菌丝体的生长，又要不影响抗生素的产量？抗生素等目的发酵产物的产量与菌丝体生长之间有何关系？第50页/共69页实验七、磷酸盐浓度对发酵目的产物的影响一、实验目的初步检测不同磷酸盐浓度对一株放线菌摇瓶发酵活性成分产量的影响，寻找一定发酵条件下，最佳磷酸盐浓度。第51页/共69页二、实验原理磷酸盐是很重要的抗生素产生菌菌丝体生长限制养分，促进初级代谢作用，在很多初级代谢过程中作为一种反应因子，除控制抗生素产生菌的DNA、RNA和蛋白质的合成外，也控制碳水化合物的代谢作用，细胞的呼吸作用和细胞内的ATP水平。无机磷抑制次级代谢作用，限制次级代谢产物合成作用的诱导物的合成，过量的磷还抑制次级代谢产物前体的形成，在许多抗生素的生物合成中，只要发酵液中的磷酸盐未耗尽，菌丝体生长就继续进行，而不合成抗生素，一旦磷酸盐耗竭，抗生素合成便开始。第52页/共69页三、实验材料菌种：摇瓶培养48h一株链霉菌的种子液。培养基成分：大豆粉，葡萄糖，酵母膏，淀粉，蛋白胨，NaCl，K2HP4，MgSO47H2O，CaCO3。其他材料、设备仪器：灭菌锅，恒温振荡培养箱，超净工作台，酒精灯，三角瓶等。第53页/共69页四、实验步骤1．培养基配制与灭菌培养基配方：大豆粉20g，葡萄糖20g，酵母膏2g，淀粉5g，蛋白胨2g，NaCl4g，K2HP4（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0）g，MgSO47H2O0.5g，CaCO32g，定容至1L，pH7.8（定容测pH后，再将CaCO3在加入培养基内）；培养基配制完后，加入150ml的三角瓶中，每瓶状液量为40ml，用湿热灭菌，灭菌温度为121℃，时间30min。第54页/共69页2．接种与培养：将生长良好的种子液按15%的接种量进行接种，接完种后置于28℃、180rpm的摇床上进行培养，培养时间为5d。3．发酵产物初步提取：发酵结束后，将发酵液进行超声破壁30min，加入乙酸乙酯30ml，100rpm摇床振荡20min，再用滤纸滤去菌丝体，滤液用分液漏斗将乙酸乙酯相分离出来，进行减压浓缩至4~5ml液体。第55页/共69页4．TLC（薄层层析）检测：将各样品浓缩液各取0.2ml，在制备型薄层层析硅胶板上进行划线点样，再利用适当的展层溶剂进行展层。展完层后待硅胶板上的溶剂完全挥发干再进行紫外检测，将目的条带刮下，以同样体积的溶剂浸泡样品，取浸泡液上清部分进行吸光度检测，如果浓度太高，则稀释后再检测。5．记录检测到的吸光度，计算目的组分的发酵效价。第56页/共69页五、注意事项选择的制备型硅胶板制板条要一致，以免影响结果。如浓度太高，则先要进行稀释，再检测吸光度。六、实验结果及分析记录实验结果，分析其原因及其说明的问题。七、思考题无机磷酸盐对发酵产物有何影响？发酵过程如何控制其适当浓度？第57页/共69页第58页/共69页实验八、正交实验一、实验目的掌握正交实验的原理，学习用正交实验来优化发酵培养基组分及各组分配比的方法。对发酵培养基中的大米、大豆粉、葡萄糖、蛋白胨等四种成分进行配比优化，确定菌株发酵培养基中它们的最佳配比。第59页/共69页二、实验原理正交设计是一种研究多因素试验的设计方法。在多因素试验中，随着试验因素和水平数的增加，处理组合数将急剧增加。n个因素M个水平的试验有Mn个处理组合，要全面实施这么庞大的试验是相当因难的。因而，D．J．Finney倡仪了部分试验法。而后日本学者倡导利用正交款式设计部分试验，称为正交试验。第60页/共69页正交试验是利用一套规格化的表格——正交表(orthogonaltable)来科学合理地安排试验。这种设计的特点是在试验的全部处理组合中，仅挑选部分有代表性的水平组合(处理组合)进行试验。通过部分实施了解全面试验情况，从中找出较优的处理组合。这样可以大大节省人、财、物和时间，使一些难以实施的多因素试验得以实施。例如，要进行一个4因素3水平的多因素试验，如果全面实施