临床基因组学课件：第4章 荧光原位杂交技术

第4章荧光原位杂交技术原位PCRCONTENTS目录FISH检测的基本原理FISH检测的流程FISH检测的临床应用概念

原位杂交(insituhybridization,ISH)是应用生物化学中核酸分子杂交的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。1969年美国耶鲁大学Gall等首先通过基因探针将核糖体基因在爪蟾卵母细胞上进行定位。概念

原位杂交(insituhybridization,ISH)是应用生物化学中核酸分子杂交的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。1969年美国耶鲁大学Gall等首先通过基因探针将核糖体基因在爪蟾卵母细胞上进行定位。1.已知的单链核酸作为探针（直接法直接标记探针）；2.按照碱基互补的原则，探针与待检材料中未知的单链核酸结合；3.特异亲和素进行荧光标记；3.使探针再用含荧光素标记的特异亲和素进行免疫化学反应；4.荧光显微镜观察荧光信号。相当于免疫学中抗原－抗体的反应FISH是一种“钓鱼”技术；通过荧光标记的探针与细胞核内的靶序列杂交获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息始于20世纪80年代按杂交对象：组织细胞染色体按探针标记物同位素（放射性）标记探针非同位素标记探针荧光标记：最常用的为生物素、地高辛(Digxigenin,DIG)、罗丹明（Rhodamine）、荧光素（Fluorescence）、PI、DAPI酶标：如辣根过氧化酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)等。按细胞周期来分间期FISH中期FISH是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定位的特殊试剂探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合上。用于原位杂交的探针有不同种类，可用于不同靶核酸的探测。FISH探针定义

1）同位素原位杂交(Isotopicinsituhybridization)

——70年代

2）非同位素原位杂交(Non-isotopicinsituhybridization)

——80年代中后期

1）免疫酶联

2）荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH)

**同位素原位杂交的不足之处：

1）不稳定；

2）高背景；

3）曝光时间长；

4）结果统计学处理繁琐。5）同位素的使用和处理

荧光原位杂交（FISH）的原理以BCR/ABL为例正常信号模式为：2G2R（如左图）典型阳性信号模式为：1G1R2F（如右图）标记位点：红:ABL(9q34)

绿:BCR(22q11)G代表绿色信号，R代表红色信号，F代表融合信号。基因片段扩增1基因片段缺失2基因片段倒位、易位等31、安全、可靠；2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度接近放射性探针；5、多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列；6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。优点

FISH探针类型

重复DNA序列单拷贝或低拷贝的DNA序列基因组DNA重复DNA序列探针重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原位杂交。容易产生较高的分辨率。因为这些DNA多拷则序列在染色体上可达几十个kb或几个Mb。日前所使用的这类探针有45SrDNA,5SrDNA、着丝点序列、端粒序列、亚端粒序列、转座子等。单拷贝或低拷贝DNA探针这类探针包括某个基因的DNA克隆.RFLP或RAPD标记。这些探针DNA序列一般只有1-2kb.因而这类标记的原位杂交存在几个方面的困难:1)需要用多层抗体结合来放大杂交信号2)杂交信号很弱时.难以与背景信号区分3)能够显示杂交信号的细胞比例很低基因组DNA探针利用不同基因组DNA同源性程度的差异。在原位杂交中只标记某一基因组或某个物种的基因组DNA。在杂交中标记的基因组DNA首先与其完全同源的DNA杂交。可以检测出导入异源多倍体的外源染色体或染色体片段，同时可以清楚地显示出易位与交换的位置。1．重复序列探针(1)着丝粒探针此类探针的杂交靶常大于1Mb，探针与靶DNA结合紧密，杂交信号强，易于检测。主要用于检测染色体的数目，鉴定单体、三体、多体、多倍体以及标志染色体等染色体异常。按染色体上位置分类探针(2)异染色质探针人类1，6，9，16号染色体着丝粒附近及Y染色体长臂含有明显的异染色质区，异染色质探针除了可代替着丝粒探针用于检测染色体数目异常外，还可用于分析涉及这些异染色质区的染色体结构改变。(3)端粒探针人体染色体长、短臂末端均有简单重复序列组成的端粒结构，端粒探针主要用于确定染色体数目、末端缺失和染色体易位等。2．涂染探针染色体涂染探针的杂交靶或为整条染色体，或为染色体的单臂，也可以是染色体的特定区带。这类探针在鉴定标志染色体的来源、染色体易位等方面效果较好。其最重要的应用是对常规细胞遗传学显带方法难以鉴定的畸变染色体进行分析。不过，染色体涂染探针常不能显示着丝粒及端粒区域。(1)整条染色体涂染探针主要用于染色体易位、重排的检测及鉴定标志染色体的来源，但其不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。(2)染色体单臂涂染探针用于染色体易位（包括臂间易位）、重排的检测及判断标志染色体的来源。(3)染色体区带涂染探针可用于检测染色体区带的扩增、缺失、倒位以及染色体间、染色体内的易位。3．基因探针及其它单基因探针是针对基因组上的单一核苷酸序列。（1）种类：YAC，BAC，Cosmid，Plasmid，cDNA片段

（2）应用

（a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证；

（b）确定染色体微小缺失与重复；

（c）染色体断裂点分析。

（d）间期细胞染色体数目异常诊断。

centromeretelomeresubtelomerelocusspecificwholechromosomepaint探针的分类CEP探针：染色体着丝粒探针GLP探针：位点特异性探针WCP探针：全染色体或染色体区域特异性探针根据化学组成，可以将探针分为:DNA探针RNA探针PNA：肽核苷酸（PNA）探针CONTENTS目录FISH检测的基本原理FISH检测的流程FISH检测的临床应用间期FISH中期FISHCONTENTS目录FISH检测的基本原理FISH检测的流程FISH检测的临床应用以BCR/ABL为例正常信号模式为：2G2R（如左图）典型阳性信号模式为：1G1R2F（如右图）标记位点：红:ABL(9q34)

绿:BCR(22q11)G代表绿色信号，R代表红色信号，