微生物的培养技术及应用（第2课时）-高二下学期生物人教版选择性必修3

微生物的培养技术及应用（第2课时）高二—人教版—生物学选择性必修3—第1章课题背景

自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时，更难实现。稀释涂布平板法呈现的杂菌群那么我们又如何达成这一目标呢？科学家们应用选择性培养基解决了这一难题。科学实例：寻找耐高温的DNA聚合酶启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。筛选原因：因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。PCR是一种在体外DNA复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。1966年，布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了耐热的Taq细菌，并分离到耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）。耐高温的酶耐高温生物体高温环境（热泉、火山口）寻找寻找一、选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。（一）概念：（二）原理：人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。（三）类型：1.利用改变培养条件进行选择培养。70～80℃的高温分离耐高温的水生栖热菌使用将pH调至酸性的培养基分离耐酸菌2.利用添加某种化学物质进行选择培养加入青霉素分离酵母菌、霉菌等真菌无氧环境分离厌氧菌3.利用营养条件（营养缺陷）进行选择培养不加碳源（含碳有机物）的培养基分离出自养型微生物不加氮源的培养基分离出固氮菌思考：如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎样设计培养基呢？思考-讨论选择培养基配方的设计尿素的立体结构尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素被土壤中某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。这些细菌之所以能分解尿素，是因为能合成脲酶，来催化尿素分解。讨论：1.你如何设计培养基配方，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来？2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？培养基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生长发育繁殖，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。见P18页培养基配方1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，判断依据是_________________________________；该类培养基的主要用途为_____________________；2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基，目的是为了获得_____________________；3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________；培养基一的碳源为________，氮源为________；培养基二的碳源为________，氮源为________。培养基一牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml培养基二KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml固体添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%~2%分离、鉴定、计数选择能分解尿素的微生物碳源、氮源、无机盐、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素讨论：资料一：通过1g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌只是其中的一部分。资料二：当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌（如图2所示）。资料三：用平板划线法接种培养的结果（如图3所示）。1.能否直接制备土壤溶液，接种到选择培养基上进行培养？为什么？如不能，需做怎样的处理？2.能否利用平板划线法对细菌进行计数？为什么？思考·讨论：图2图3①不能。②因为土壤中细菌的数量庞大，直接制备土壤溶液接种到选择培养基上无法统计数量。③接种到选择培养基前需要对土壤溶液进行充分稀释。①不能。②平板划线法最开始的划线很可能菌落会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分菌类。如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，我们应该如何统计呢？二、微生物的选择培养——稀释涂布平板法稀释涂布平板法1.原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。

如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，还需对土壤菌液进行稀释及科学的微生物数量测定方法---稀释涂布平板法。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml1072.样品梯度稀释：微量移液器稀释10倍菌液101土壤10g

②在火焰旁称取土壤10g，加入90ml无菌水中，摇匀，制成稀释10倍的土壤菌液。分别取1ml上清液，加入盛有9ml无菌水的试管中，制成不同稀释倍数的菌液。取6支试管，分别加入9ml无菌水。灼⑤将涂布器在火焰上灼烧，待酒精燃尽后，涂布器冷却后，再进行涂布。涂⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。各梯度分别涂布3个平板1个不涂布作空白对照3.取样涂布平板：滴③取0.1ml菌液（不超过

），滴加到培养基表面④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中浸放入37℃恒温箱中培养1～2d4.培养与观察稀释103倍稀释104倍稀释105倍空白对照恒温培养箱疑问解答平板划线法和稀释涂布平板法有什么不同？平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具用途接种效果图相同点将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养得到单菌落接种环涂布器①都能分离纯化菌种；通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散，进行培养得到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落；②用于计数②都是在固体培养基上进行。三、微生物的数量测定——间接/活菌计数法（一）稀释涂布平板法稀释涂布平板法除用于分离微生物外，也常用于统计样品中活菌数。在稀释度足够高时，培养基上表面生长的一个单菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，可推测出样品中大约有多少活菌。1)原理：2)计数原则：一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。注意事项①为了保证结果准确，一般选择菌落数在30—300的平板上进行计数。②为增强实验说服力与准确性，设计实验时，需要涂布至少三个平板作为重复组。（重复实验，减少误差）。③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。④因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数表示。⑤分析实验结果时，要考虑重复组结果是否接近，如果相差太大，意味着操作有误，需重新实验。因为当两个或多个细胞连在一起时，繁殖后形成的还是一个菌落实例分析：甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。（80+90+100）/30.1×105=9×107个3)计算：三、微生物的数量测定（二）显微镜直接计数法——直接计数法1.原理：利用特定的细菌计数板或血细胞计数板在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。（统计的是微生物本身的个体数）每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”）2.计数工具：显微镜、血细胞/细菌计数板计数池0.1mm每个计数室面积1mm2，液体高度0.1mm，所含液体体积为0.1mm3，即1×10-4mL（0.1mm3=0.1×10-3cm3=10-4mL）。中方格血细胞计数板常用于_____________________

的计数酵母菌等相对较大的细胞细菌计数板可对_____________的计数细菌等较小的细胞计数室1mm大方格小方格血细胞计数板2.计数工具：显微镜、血细胞/细菌计数板计数室16个中方格25个中方格25个小方格16个小方格16×25一个计数室有400个小方格，每个小方格的面积为1/400mm2，总体积为0.1mm3。25×16血细胞计数板3.结果计算（以血细胞计数板为例）：每个中方格平均菌株数×16/2510-4×稀释倍数菌株个数/mL=（2）计数规则：（3）计算公式：（1）计数方法：五点/四点取样法样方内＋样方线上的上、左两边及左顶角4.结果分析（以血细胞计数板为例）：（取多个方格求平均值）统计的细菌数目往往比活菌的实际数目多原因是统计的结果是活菌数和死菌数的总和疑问解答稀释涂布平板法(间接/活菌计数法)和显微镜直接计数法（直接计数法）各有哪些优缺点？项目稀释涂布平板法(间接/活菌计数法)显微镜直接计数法（直接计数法）原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌利用特定的血细胞计数板，在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量主要用具培养基、涂布器显微镜、细菌计数板或血细胞计数板计数依据培养基上的菌落数菌体本身个数计算公式每毫升原液所含细菌数＝某一稀释度下培养基上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数每毫升原液所含细菌数＝每中格平均菌体数25/16×104××稀释倍数优点缺点计数的是活菌计数方便、操作简单①死菌、活菌都计算在内；②操作较复杂。①统计结果有一定误差：统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；②统计结果有一定误差：统计的数目往往比活菌的实际数目多。探究-实践

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数尿素的立体结构提出问题1.从土壤中分离出能够分解尿素的细菌2.统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌研究思路土壤取样制备培养基样品稀释与取样涂布微生物的培养与观察绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。基础知识1.制备培养基：（1）选择培养基：以尿素作为唯一氮源（2）牛肉膏蛋白胨培养基组分含量牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g琼脂20.0g蒸馏水定容到1000ml组分含量KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g琼脂15.0g蒸馏水定容到1000ml（用来分离分解尿素的细菌）（用来设计对照组实验）实验设计2.土壤取样：（1）取样地点要求：（2）取样部位：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。酸碱度接近中性的潮湿且富含尿素的土壤。

在城市，常见的是公园里、街道旁、花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或菜园里的土壤。思考与讨论：（1）分离土壤中不同的微生物采用稀释范围相同吗？测定土壤中细菌的总量稀释度高还是测定能分解尿素的细菌的数量稀释度高？（2）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？如何证明已稀释成功？（3）每个稀释度至少涂几个平板？①不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。②测定土壤中细菌的总量稀释度更高，因为细菌总数量高于能分解尿素的细菌数量。（1）测细菌数：一般用104、105、106稀释液（2）测放线菌数：一般用103、104、105稀释液（3）测真菌数：一般用102、103、104稀释液3.样品的稀释与涂布平板思考与讨论：（1）分离土壤中不同的微生物采用稀释范围相同吗？测定土壤中细菌的总量稀释度高还是测定能分解尿素的细菌的数量稀释度高？思考与讨论：（2）在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？如何证明已稀释成功呢？①在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，应选择一个比较宽的范围，例如可以将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。3.样品的稀释与涂布平板如果得到2个或2个以上菌落数目在30-300的平板，且同一稀释倍数的三个重复平板上菌落数相差不大，可进行菌落计数，若菌落数相差太大，说明实验误差大，需重新实验。②如果得到2个或2个以上菌落数目在30-300的平板，说明稀释操作成功。思考与讨论：3.样品的稀释与涂布平板（3）每个稀释度至少涂几个平板？每个稀释度至少设置4个平板：①1、2、3平板是选择培养基②4平板为牛肉膏蛋白胨培养基③此外，整个实验还要多设置2个平板：（作为对照，用来验证两种培养基中是否被杂菌污染）（作为实验组，且设置三个重复，用来分离分解尿素的细菌）（作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择作用）不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。4.微生物的培养与观察（1）培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度、pH和培养时间。细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d。（2）观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。（3）一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小、颜色、透明度、光泽度和隆起程度等。5.菌落计数当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数，同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。请尝试设计实验结果记录表。稀释度104105106107123平均值123平均值123平均值123平均值菌落数/平板实验结果记录表：

操作提示2）无菌操作3）做好标记

本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前要做好标记4）制定计划对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率，在操作时更加有条不紊1）不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。a.取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。b.应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入

锥形瓶中，塞好棉塞。c.在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。小结练一练1．培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是（）①化学消毒法②灼烧灭菌法③干热灭菌法④紫外线消毒法⑤高压蒸汽灭菌法⑥巴氏消毒法A．⑤③②①④⑥B．①②③④⑤⑥C．⑥②③④①⑤D．③④②①⑥⑤

2．下列培养基配方中，能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是（）A．②③B．③①C．②④D．①④A原料蛋白胨乳糖蔗糖K2HPO4伊红亚甲蓝琼脂NaCl蒸馏水①10g5g5g2g0.4g0.065g10g-1000mL②10g5g5g2g--20g-1000mL③10g5g5g2g---20