流感禽流感实验室诊断及新技术新进展详解演示文稿

流感禽流感实验室诊断及新技术新进展详解演示文稿当前1页，总共78页。（优选）流感禽流感实验室诊断及新技术新进展当前2页，总共78页。流感病毒病原学3（1）血凝素(HemagglutininHA)：（柱形）凝集红细胞—血凝现象，用于鉴定病毒吸附宿主细胞—与受体结合（侵入细胞的关键）抗原性—相应抗体，有中和作用易变异（分亚型）（2）神经氨酸酶（NeuraminidaseNA）：（蘑菇形）参与病毒释放，促进病毒扩散抗原性易变异（分亚型）（3）病毒变异：抗原漂移和抗原转变当前3页，总共78页。亲脂类病毒或中等大小的病毒（如：HSV,CMV,RSV,HIV,HBV）细菌繁殖体（如：金葡，绿脓）真菌（如，念珠菌属，曲霉属）非脂类或小病毒（如脊髓灰质炎病毒,柯萨奇病毒）分枝杆菌（如TB，M.terrae）Cryptosporidiumparvum隐孢子虫

细菌芽孢Prions敏感耐受低效中效高效灭菌（高，延时）消毒剂水平气体灭菌蒸汽灭菌

理化特性：病毒对乙醇、碘伏、碘酊敏感；对热敏感，56℃30分钟可灭活。当前4页，总共78页。流感病毒病原学5宿主范围：人、猪、马、禽类等宿主界限不十分严格，在一定的条件下可突破种间屏障，在不同种间传播动物流感同人类流感关系密切。猪是储存宿主，也可能是“混合器”当前5页，总共78页。流感病毒病原学6培养特点细胞、动物致病性和免疫性病毒侵入人体后在呼吸道黏膜和肺部繁殖，病毒和其代谢产物进入血液引起相应的临床症状。引起体液和细胞免疫当前6页，总共78页。流感监测目的（一）监测流感活动水平和流行动态；（二）及时发现流感病毒变异并作出预警；（三）为全球及我国流感疫苗毒株的预测和推荐提供依据。当前7页，总共78页。流感监测内容（一）流感样病例监测（二）流感样病例暴发疫情监测当前8页，总共78页。流感样病例监测标本采集采集对象：流感样病例

发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者采集时间：病人发病的头3天内采集，最好是24h内采集地点：国家级流感样病例监测哨点医院采集数量：根据就诊ILI病例数的多少，每家哨点医院每周至少采集20份流感样病例的标本(根据流行季节、流行强度、防控工作需要实时调整）当前9页，总共78页。暴发疫情标本采集（1）1周内，在同一学校、幼儿园或其他集体单位发生30例及以上流感样病例；或发生5例及以上因流感样症状住院病例（不包括门诊留观病例）；或发生2例及以上有流行病学关联的死亡病例；（2）在某一社区内（如同一乡或街道）1周内出现流感样病例异常增多。每一起暴发疫情一般应当采集10份咽、鼻拭子标本（如果现症病例在10例以下的，应当全部采样）。当前10页，总共78页。采集标本类型常规

特殊咽拭子鼻咽/呼吸道吸取物鼻拭子鼻洗液、含漱液血清呼吸道灌洗液肺组织活检标本尸检标本当前11页，总共78页。采样液常用的采样液有：的Hank’s液或MEM；标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，同时加入抗菌素（入庆大霉素50mg/mL，多粘菌素B250μg/mL）当前12页，总共78页。咽拭子采集咽拭子

用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。注意：采样前1h内不要进食和饮水，采样液中严禁加入抗生素当前13页，总共78页。标本的保存与运送标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网络实验室未能送至实验室的，应置-70℃或以下保存，一周内送实验室冻存的标本，尽量避免其反复冻融，在冷藏条件下送到实验室当前14页，总共78页。实验室生物安全要求季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ级实验室进行。流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。用灭活的抗原进行血清学检测时可以在生物安全Ⅰ级实验室进行当前15页，总共78页。标本的接收接收标本时必须核对送检表流感监测网络实验室的工作人员接到标本后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例标本原始登记送检表”（表2）录入到“监测信息系统”当前16页，总共78页。标本的处理标本送至实验室后，立即进行处理，未加抗菌素的加入适量的抗菌素。将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于MDCK细胞接种，一份（1ml）用于鸡胚接种，一份（1ml）保存待复核。（根据检测程序实时调整）当前17页，总共78页。实验室检测分子诊断RT-PCR、real-timeRT-PCR主要选用的基因片段：M基因-检测A型流感，NS基因-检测B型流感，HA基因-检测禽流感、季节流感H1/H3以及其他亚型病毒分离和血凝抑制试验可用MDCK细胞和SPF鸡胚分离流感病毒，对于高致病性禽流感病毒分离要求BSL-3实验室；可以诊断感染，但无法为临床诊断及时提供结果。快速试纸条法一些商用快速检测可以区分A和B型流感病毒，但是检测季节性流感病毒的灵敏度不佳。因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为禽流感感染的最后诊断。免疫荧光法免疫荧光试验可以区分A和B型流感病毒。免疫荧光试验的结果取决于临床标本的质量，操作技能。因此，免疫荧光试验阴性结果可能是假阴性，不能作为禽流感感染的最后诊断。血清学当前18页，总共78页。季节性流感检测流程临床标本采集接种MDCK细胞接种鸡胚红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒红细胞凝集试验流感病毒核酸检测阳性PCR鉴定当前19页，总共78页。人感染高致病性禽流感标本实验室检测流程图呼吸道、尸检标本、其它标本病毒分离和鉴定标本采集对象血清标本HI试验、微量中和试验、单扩溶血报告采集检测第三份血清双份血抗体滴度4倍增长核酸检测：RT-PCR或Real-TimePCR，引物至少应包括A、两对H5再次采样再次检测按照人流感监测方法分离鉴定可疑A及两对H5阳性阳性两对H5阴性阴性扩增产物序列测定

双份血抗体滴度无4倍增长报告报告当前20页，总共78页。核酸检测的原理核酸提取的原理PCR的原理实时荧光定量PCR的原理当前21页，总共78页。核酸提取的原理无论是从真核细胞或是从细菌病毒中提取核酸，涉及的基本原理是使细胞膜或细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，再用某些有机溶剂抽提使核酸分离或使核酸吸附于某些颗粒的表面，再进行沉淀或洗脱，从而获取核酸。当前22页，总共78页。核酸提取核酸提取-QIAamp®ViralRNAMiniKit1）在1.5ml离心管中加入AVL（病毒裂解液）560ul。2）取采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）140ul加入上述离心管中（粪便标本用10％悬液的上清），震荡15s，室温放置10min。3）稍离心后，加入560ul无水乙醇，震荡15s。4）将ViralRNAMinispin柱子取出，将步骤3的混合液吸取630ul加入柱子中，8000rpm离心1min。弃离心液。5）重复步骤4。6）将吸附柱放入一新的2ml套管中，加入500ulAWl液，8000rpm离心1min。弃套管及其离心液。7）将吸附柱放入一新的2ml套管中，加入500ulAW2液，13000rpm离心3min，弃套管及其离心液。8）将吸附柱放入一新的1.5ml离心管中，于柱中加入60ul的AVE液，室温静置1－3分钟，8000rpm离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即实验或－20℃以下保存。当前23页，总共78页。PCR技术的原理生物体的遗传物质：核酸（DNA/RNA）碱基序列的长度和排列的顺序决定了生物的多样性。人类体细胞中有31亿个碱基对。除了真正双胞胎外,每个人的DNA是独一无二的,就好像指纹一样。当前24页，总共78页。PCR技术的原理PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的DNA片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。特异性：引物序列灵敏度：扩增100万倍1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~35轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍当前25页，总共78页。RT-PCR和real-timePCRRT-PCR：即逆转录PCR，扩增的模板为RNA，增加RNA→DNA过程。Real-timePCR：即实时荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。当前26页，总共78页。RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation双标记探针（TaqmanProbe）当前27页，总共78页。荧光定量PCR第一次使用前引物稀释1．引物工作浓度（40μM）配制方法：（1）将新合成的引物开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。（例如：假设合成引物每管2OD，若2OD的量为9.1nmol，加水量为10×9.1＝91μl）（3）将100μM的引物2.5倍稀释，此时浓度为40μM，可作为工作浓度。2．探针工作浓度（10/20μM/）配制方法：（1）将新合成的探针管开盖前短暂离心（12000rpm，15s）。（2）用RNaseFreeWater溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时引物浓度为100μM，可作为储存液。（3）将100μM的探针10/5倍稀释，此时浓度为10/20μM，可作为工作浓度。当前28页，总共78页。荧光定量PCR引物和探针稀释好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；涡旋振荡引物和探针；瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。real-timeRT-PCR的试剂QIAGEN公司QuantiTectProbeRT-PCRKit，CatNo.204443注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。当前29页，总共78页。荧光定量PCR反应体系和条件试剂：InvitrogenSuperScript®IIIPlatinum®One-StepQuantitativeKit（公司：Invitrogen，货号：11732-020或11745-100）分子级无菌蒸馏水(无RNA酶和DNA酶)正反向引物(40μM)双重标记探针(10μM)反应条件：逆转录50℃30min→95℃2min→（95℃15s→55℃30s*）×45反应体系为25ul注：*在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）当前30页，总共78页。荧光PCR结果－阳性样品当前31页，总共78页。荧光PCR结果－阴性样品当前32页，总共78页。荧光PCR结果－可疑样品当前33页，总共78页。病毒分离-MDCK细胞标本接种MDCK细胞每日观察细胞病变(CPE)MDCK细胞收获33－35℃培养当前34页，总共78页。接种流程清洗MDCK细胞临床采样标本接种细胞Hank’s液清洗细胞，一般清洗2遍33－35度吸附1－2小时Hank’s液清洗细胞加入病毒生长液，33－35度培养箱培养24小时后，观察细胞病变。当细胞病变为3+或4+时，即75～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前将细胞冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于第7天收获（细胞病变情况：细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）根据使用的细胞瓶的大小，决定接种量，一般的小细胞瓶接种0.5ml的临床标本流程图当前35页，总共78页。MDCK细胞病毒分离CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性有关每日观察细胞病变(CPE)标本接种后7天还未出现CPE，维持液经HA试验阴性者，继续盲传1～2代后，HA试验仍为阴性者，则MDCK细胞病毒分离为阴性，标本可弃去当前36页，总共78页。细胞病变图当前37页，总共78页。鸡胚病毒分离标本接种于9日龄鸡胚33℃～35℃培养72小时检卵标本准备当前38页，总共78页。当前39页，总共78页。鸡胚分离方法-试剂准备1)

9～11日龄鸡胚2)

照蛋灯3)

70%～75％酒精4)

1ml一次性注射器5)

鸡蛋开孔器6)

无菌胶布或蜡7)

10ml试管和试管架8)

10ml移液管或1ml移液器及无菌吸尖9)

无菌镊子10)无菌眼科剪当前40页，总共78页。鸡胚分离方法-标记鸡胚■检视标记鸡胚◆

用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限

◆标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部的位置

◆如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉当前41页，总共78页。■接种病毒方法◆

单腔接种盲种◆双腔接种灯下接种

开窗接种鸡胚分离方法当前42页，总共78页。鸡胚分离流程（1）

◆将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样本接种3个鸡胚

◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm窗口

◆用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16号针头

◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100µl标本。将针头退出至½寸，将另外100µl标本注入鸡胚尿囊腔当前43页，总共78页。鸡胚分离流程（2）◆用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚◆将针头弃于合适的生物安全装置中◆用消毒过的医用胶布封口◆

33～35oC温箱培养鸡胚2～3天。临床采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养2天鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去当前44页，总共78页。鸡胚分离流程（3）■收获尿囊液和羊水■鸡胚在收获前应4℃过夜或至少放置4小时■标记15ml无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致■用70%～75％酒精消毒鸡胚顶部■用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。用10ml吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。用吸管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并当前45页，总共78页。鸡胚病毒鉴定经HA试验阴性者，将羊水和尿囊液混合，继续盲传1代（72小时），如仍为阴性，则鸡胚病毒分离为阴性，标本可弃去鸡胚收获HA试验当前46页，总共78页。病毒鉴定红细胞凝集红细胞凝集抑制试验当前47页，总共78页。病毒鉴定流程红细胞凝集试验4个凝集单位配制“回滴”红细胞凝集抑制试验判定流感病毒型别当前48页，总共78页。红细胞凝集试验（HA）MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度

原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血凝素结合后，可以抑制凝集现象出现当前49页，总共78页。红细胞鸡火鸡豚鼠人O型血红细胞马适用范围流感和禽流感病毒流感和禽流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒终浓度（％）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形状U或V型U或V型U型U型U型孵育时间30min30min45min45min60min细胞对照细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成圆点状，倾斜时细胞向下流成泪滴状细胞沉积成环状细胞沉积成环状细胞沉积成环状当前50页，总共78页。AHBCDEFG100ul病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液50ulPBS稀释病毒加入配制好的红细胞悬液充分混匀，置室温孵育30-60分钟观察记录结果当前51页，总共78页。病毒原液1：21：128HA：32HA＞128HA：4当前52页，总共78页。红细胞凝集试验（HA）HA滴度≥8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；HA滴度<8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定若传1～2代后，HA滴度仍<8者，可应用核酸检测方法进行鉴定当前53页，总共78页。红细胞凝集抑制（HI）试验HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A（H3N2）、抗B（Victoria系）和抗B（Yamagata系）4种标准参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。当前54页，总共78页。红细胞凝集抑制试验步骤4个凝集单位的配制和检测稀释血清加入25ul4个血凝单位抗原，室温孵育15-30分钟每孔加入50ul红细胞悬液，充分摇匀。室温孵育30-60分钟观察记录结果当前55页，总共78页。4个凝集单位的配制和检测4个凝集单位的配制读取红细胞凝集试验的结果计算所须的4个凝集单位的病毒用量用50ul检测4个凝集单位时，用凝集效价除以8，所得商即为4个单位的稀释度用红细胞凝集试验“回滴”，复核4个凝集单位用50ul，前4孔完全凝集。此时的抗原即为4个凝集单位当前56页，总共78页。红细胞凝集抑制试验稀释血清12765349810H1血清50ulH3血清50ul50ulPBSB血清50ul25ulPBS25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ul25ulB血清50ulH3血清50ulH1血清50ul当前57页，总共78页。流感病毒的型别判定标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价≥20才可以算为阳性一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清抑制待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判定为此型别的流感病毒当前58页，总共78页。红细胞凝集抑制试验-质量控制使用的试剂可靠无误处理后的血清有无残余非特异性凝集素读取HA试验的结果是否正确4个血凝单位是否准确红细胞阴性对照待鉴定病毒确保没有被细菌污染稀释血清、病毒、红细胞悬液加入量准确当前59页，总共78页。一代测序原理：Sanger

测序－双脱氧末端终止法

1977年，英国人Fred

Sanger

发现，如果在DNA复

制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止

的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端

终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位

置的ddNTP决定的。

1980年诺贝尔化学奖

带负电的ＤＮＡ分子向正极泳动，片段的迁移率取决于分子量：小分子量的片段比大分子量的片段泳动得快。CHINESE

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DISEASE

CONTROL

AND

PREVENTION当前60页，总共78页。CHINESE

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PREVENTION技术的进步•

以Sanger法（双脱氧核苷酸末端终止法）为代表的第一代测序技术帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组图谱等大量测序工作，但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是后基因组时代最理想的测序方法。•

进入21世纪后，以Roche

454、Illumina

Solexa和ABI

SOLiD为代表的第二代测序技术诞生了，并迅速掀起了你

追我赶的技术比拼高潮。测序技术的进步。测序通量不断

提升，测序成本不断降低，现在已经进入了一千美元测一

个人全基因组的时代。当前61页，总共78页。CHINESE

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AND

PREVENTION下一代测序技术•

下一代测序技术（next-generation

sequencing）是对传统Sanger法测序的

一次革命性的改变，是一次可对几十万到

几百万条DNA分子进行序列测定的高通量

的测序技术，同时高通量测序使得对一个

物种的转录组和基因组进行细致全貌的分

析成为可能，所以又被称为深度测序(deep

sequencing)。当前62页，总共78页。为什么要使用二代测序技术•

一代测序对已知病原体进行测序（需要特异性扩增）•

对基因组较大的物种进行测序•

可得到更准确的数据（数据覆盖度更高）•

可对原始标本和病毒含量低的样品进行测序•

对变异频繁的病原体进行测序•

检测低频突变•

排除其他病原体感染•

混合样本测序以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间,而使用二代测序技术则仅仅需要1周当前63页，总共78页。为什么流感病毒适用于NGS

H3N2,

H13N9H3N8,H7NH3N2

,H4N5

7

H1-H16,

N1-N9H3N8

H1N1,

H2N2,

H3N2,

H5N1,

H7N7,

H9N2,H10N7

H4,

H5,

H6,H7,H9,

H10

,H7N9

N1,N2,N4,N7

H5N1,

H7N7,

H9N2,

H7N9

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CONTROL

AND

PREVENTION

H4N6H1N1,

H1N2,H2N3,

H3N2,H4N6当前64页，总共78页。CHINESE

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PREVENTION利用CoverageAnalysis插件可以进行禽流感分型Subtype:H9N2Subtype:

H7N9当前65页，总共78页。CHIESE

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AND

PREVENTIONH7N9和H9N2混合感染（培养样品）H7N9和H9N2混合感染（环境样品）环境样品及其培养样品的比较：环境样本也能很好地分型当前66页，总共78页。•

《Clinical

and

epidemiological

characteristics

of

a

fatal

case

of

avian

infl

uenza

A

H10N8

virus

infection

:

a

descriptive

study》Timeline

of

the

clinical

course

of

the

patient

and

identification

of

causative

pathogen

Frequency

of

glutamic

acid

was

87.6%

versus

12.4%

for

lysine

in

the

sample

obtained

on

day

7,

and

frequency

was

3.3%

versus

96.7%

on

day

9.深度测序发现PB2的第627位的杂合突变Glu/Lys,其与病毒感染哺乳动物相关；在治疗过程中，Lys的突变比例增高对应其逐渐增强的毒力

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CONTROL

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PREVENTION当前67页，总共78页。(Virus)

Evolution进化生物学是研究生命的起源及进化的过程、原因、机制、速率和方向的科学起源（Origin）：从哪里来？进程（Process/Route）：怎么来的？原因（Causes）：为什么会来？机制（Selection）：谁驱动它？速率（Dynamics）：快？慢？方向（Direction）：要去哪？当前68页，总共78页。Evolution

of

Evolutionary

Methods简单分子

数据复杂分子

数据简单个体

样本复杂群体

样本PhylogeneticsIntra-host

VariationsCoalescence

???当前69页，总共78页。20