克隆基因的表达

克隆基因的表达第1页/共121页

原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。第2页/共121页pIJ486是链霉菌的质粒（如下图所示），其中neo和tsr分别为新霉素和硫链丝菌素的抗性基因。为了准确克隆并筛选出目的DNA片段的克隆，最为理想的插入位点是？说明其原因？

位点为tsr内的EcoRV。当外源基因插入EcoRV位点时，硫链丝菌素基因失活。利用新霉素来筛选重组子。第3页/共121页怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去?

化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。第4页/共121页列举两种外源基因转化的方法?如何提高其转化效率?CaCl2处理后的细菌转化或转染：低温和CaCl2处理制备感受态细胞，使细胞膜通透性增加，处于容易捕捉和接受外源DNA的状态。电穿孔转化法：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。质粒的大小，拷贝数；受体细胞的状态；转化的外在条件，如温度等;质粒与宿主菌的比例。第5页/共121页建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?第6页/共121页1基因表达的机制1.1外源基因的起始转录

外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。原核生物启动子诱导型启动子：组成型启动子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的启动子如T7噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。第7页/共121页mRNA的延伸与稳定外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。一方面，要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的mRNA转录提前终止的现象；另一方面，又要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。第8页/共121页外源基因mRNA的有效翻译外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：AUG(ATG)是首选的起始密码子。SD序列为与核糖体16SrRNA互补结合的位点，该序列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。第9页/共121页不同基因组使用密码子具有选择性。主密码子（majorcodon）罕用密码子（rarecodon）如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高；反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效率就低。第10页/共121页1.4表达蛋白在细胞中的稳定性避免外源基因表达蛋白降解的对策：构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统第11页/共121页1.5目的基因沉默基因沉默的作用机制位置效应的基因沉默：转录水平的基因沉默：转录后水平的基因沉默：是指基因在基因组中的位置对其表达的影响是在DNA水平上的基因调控是在RNA水平上的基因调控第12页/共121页第七章

克隆基因的表达基因激活转录起始mRNA水平蛋白质水平第13页/共121页克隆基因的表达第一节基因表达的基本过程第二节外源基因在原核细胞中的表达第三节外源基因在真核细胞中的表达第四节提高外源基因表达效率的途径第14页/共121页

基因表达(geneexpression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。第一节基因表达的基本过程第15页/共121页基因表达的基本过程第16页/共121页基因表达的基本过程

基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。首先，目的基因通过转录(transcription)形成mRNA（信使RNA,messengerRNA)；

然后，tRNA（转运RNA,transferRNA）将各种氨基酸运送到核糖体并按照mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列(translation)最终得到基因的表达产物（蛋白质）。第17页/共121页基因表达机制1.外源基因的起始转录外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤，转录起始的速率是基因表达的限速步骤。因此，启动子是关键。2.mRNA的延伸和稳定性外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。另外，mRNA的稳定性直接决定翻译产物的多少。第18页/共121页思考:基因表达与克隆基因表达的异同?表达的对象、过程、场所第19页/共121页克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。第20页/共121页第21页/共121页基因激活转录起始mRNA水平蛋白质水平第22页/共121页原核中表达真核中表达外源基因第23页/共121页用原核生物作宿主。AdividingE.coli

第一节

外源基因在原核细胞中的表达原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子第24页/共121页大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物第25页/共121页大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素第26页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第27页/共121页识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。一、原核生物基因表达的特点2.以操纵子为单位1.只有一种RNA多聚酶第28页/共121页乳糖操纵元（lacoperon）的结构lacIlacZlacYlacA

PlacIPlac

OlacRNADNAlacZlacYlacA

lacI乳糖阻遏物（单体、四聚体）-半乳糖苷酶

渗透酶乙酰转移酶Protein乳糖葡萄糖＋半乳糖

增加乳糖的吸收功能未知第29页/共121页有意义链5’

反意义链3’

转录mRNA5’

3’

翻译蛋白质NC5’

3’

3.转录和翻译偶联、连续进行。第30页/共121页第31页/共121页4.不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5.调控主要在转录水平上。

含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6.mRNA的核糖体结合位点Shine-Dalgarno（S-D）sequence:第32页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第33页/共121页二、原核表达系统的注意事项外源基因不能带有内含子。2.必须用cDNA3.不能直接用真核基因组DNA。4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。为何？第34页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第35页/共121页大肠杆菌基因表达载体基本结构特征三、原核生物基因表达的调控第36页/共121页是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。

大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensussequence）。

1.启动子-35Box和

-10Box（1）

启动子序列

第37页/共121页consensussequences第38页/共121页5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

②-10box（PribnowBox）TTGACA

TATAAT

转录起始位点17bp5’

核糖体结合位点RNA聚合酶

亚基的识别位点

。①-35box第39页/共121页原核启动子共有序列的功能第40页/共121页2翻译的起始位点①核糖体结合位点（

RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）

sequence：mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。ribosomebindingsiteSDmRNA5’—AGGAGGU——AUG——

16SrRNA3’

UCCUCCAS-D序列距离AUG的距离也影响翻译第41页/共121页AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）位于SD序列下游。ii）起始密码：第42页/共121页全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。

3RNA多聚酶

大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。结构第43页/共121页4.转录终止子内终止子intrinsicterminator：E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。启动子操纵子S-D序列目的基因终止子第44页/共121页由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。

终止形成的原因：反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA与DNA的互作①茎环结构②多聚A/U第45页/共121页5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTCTTTCT-33-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)转录↓5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA)RNA折叠↓mRNA折叠

UCC

UGG—CA—UC—GC—GG—CC—GC—GG—CAA

CCCACUUUU—3

DNARNA聚合酶脱落第46页/共121页大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。5.翻译终止密码6.翻译增强子Translationenhancer能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）;大肠杆菌atpE基因mRNA5’-UTR中富含U的区段。21第47页/共121页1基因表达的机制1.1外源基因的起始转录

外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。原核生物启动子诱导型启动子：组成型启动子：如lac、trp、λPR、λPL、tac等的启动子如T7噬菌体的启动子真核生物启动子也可分为诱导型和组成型等类型。第48页/共121页①必须是一种强启动子能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。②应呈现低水平的基础转录便于表达毒性蛋白等。③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。最佳启动子必须具备的条件

7.基因工程常用的原核启动子

第49页/共121页第50页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第51页/共121页四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达（1）包涵体（inclusionbody）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。第52页/共121页在大肠杆菌细胞内表达人生长激素（humangrowthhormone,hGH）。例：使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。②缺点①优点第53页/共121页2.周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。第54页/共121页由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3.胞外表达或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。第55页/共121页第56页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第57页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第58页/共121页载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG优点五、几种类型的原核表达载体1.非融合型表达载体产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。第59页/共121页哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。举例：pKK223-3载体组成结构：①强启动子:tac（trp-lac）:trp的-35区lacUV5的-10区lac操纵基因②操纵基因：乳糖操纵子系统。第60页/共121页④终止子：③调节基因：LacI宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。

如JM105菌。rrnB的强终止子rrnB强终止子S-D插入位点区⑤S-D序列和插入位点区：第61页/共121页tacPLacOS-D插入位点区rrnBT宿主lacI⑥载体的其余部分：来自pBR322质粒。⑦表达诱导物：

IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物IPTG第62页/共121页启动子第63页/共121页载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pINIII系列：

2.分泌型表达载体pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,（1）组成结构第64页/共121页IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。②调节基因：lacI③S-D序列和起始密码ATG。④分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。⑤插入位点区（多克隆位点）。①强启动子：第65页/共121页pINIII-comA1第66页/共121页第67页/共121页表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。①启动子：tac②操纵基因：lacP③调节基因：lacI④S-D序列3.融合蛋白表达载体系统----pGEX系列（1）优点（2）组成结构便于融合蛋白的分离和纯化。22第68页/共121页lacItaclacOS-D/ATGGST插入位点TGAlacP⑤ori：pBR322ori⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。（3）产物提纯第69页/共121页（4）产物分离用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶

外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用第70页/共121页（5）其他融合蛋白系统His-tag（组氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。第71页/共121页人胰岛素在大肠杆菌中的表达溴化氰Cyanogenbromide：第72页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第73页/共121页5’-TTGACA-3’

5’-TATAAT-3’

①-35box②-10box（PribnowBox）六、影响外源基因表达效率的因素1.启动子的结构对表达效率的影响RNA聚合酶

σ亚基的识别位点（1）一致顺序第74页/共121页（2）-35区与-10区之间的距离间隔为17bp时，启动子最强。（3）

-35区和-10区的碱基顺序越接近一致顺序，启动子越强。5’-TTGACA

TATAAT

一致顺序lactrpPL

recAtacItacII5’-TTTACA

TATGTT

5’-TTGACA

TTAACT

5’-TTGACA

GATACT

5’-TTGATA

TATAAT

5’-TTGACA

TATAAT

5’-TTGACA

TTTAAT

-35box-10box第75页/共121页5’-AGGAGGU-3’

S-D序列后面的4个碱基：如果是A（T）,翻译效率最高；如果是G（C）,效率只有50%或25%。2.转译起始序列对表达效率的影响（1）S-D序列？？？？SD序列与16SrＲＮＡ分子之间的碱基互补程度，可明显地影响mRNA的转译速率．当序列为５‘－ＧＧＡＧＧ－３’，可与16SrＲＮＡ３‘端完全互补，转译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，转译效率便会下降３０倍．第76页/共121页AUG左侧的三个碱基也有影响。（2）起始密码AUG-半乳糖苷酶的mRNA中：AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。AUG右侧的三个碱基也有影响。第77页/共121页多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。（3）

其它终止子能有效控制目的基因mRNA的长度、提高mRNA的稳定性第78页/共121页3.启动子与外源基因之间的距离第79页/共121页转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。4.转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。第80页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第81页/共121页选择强启动子序列，如tac

等七、提高表达水平常用的方法2.调整S-D序列与AUG碱的距离距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。3.改变起始密码下面的几组密码子一般为5-9bp。能提高翻译的起始效率。第82页/共121页4.增加mRNA的拷贝数和稳定性在外源基因的下游插入“重复性基因外回文序列”能防止mRNA受到3’5’外切酶的攻击。5.减轻宿主细胞的代谢负荷合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。将宿主生长代谢与外源基因表达分开。（1）诱导表达

一般采用温度诱导或药物诱导。第83页/共121页cI857阻遏物有活性，抑制PL启动子，外源基因不表达，宿主大量生长。32°C:42°C:cI857阻遏物失活，PL启动子启动，外源基因高水平表达，宿主生长受到限制。cI857PL外源基因POPL启动子是温度诱导型第84页/共121页调节基因lacI（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。无IPTG:阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。有IPTG:阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。tac启动子是药物诱导型第85页/共121页（2）表达载体诱导复制

将宿主的生长与载体的复制分开。当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。第86页/共121页N末端：由原核基因编码一段多肽，C末端：是完整的真核外源基因。（1）设计成融合蛋白

这是避免被降解的最好措施。质粒基因产物目的基因产物NC切割6.提高表达产物的稳定性防止被宿主的酶降解。第87页/共121页Z系列载体：ZUV5载体:lacZGAATTCCTTAAG外源基因Z2载体:lacZGGGAATTCCCCTTAAG外源基因Z3载体:lacZGGAATTCCCTTAAG外源基因提供三种融合插入阅读框。第88页/共121页①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。②大肠杆菌的htpR基因突变也减少蛋白酶的降解作用。③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。（2）

使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解

减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。第89页/共121页（3）表达分泌蛋白

细胞质外膜内膜周间质质粒染色体“外排”：

蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。“分泌”：

蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。第90页/共121页细菌蛋白分泌的条件：位于N端，一般为15-30aa。真核与原核的结构相似,功能相似，可以互换。

碱性氨基酸N疏水氨基酸核心区切割位点Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信号肽酶外源蛋白

①有信号肽。第91页/共121页③细胞内的转运机制。真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达；但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。②蛋白质内有与分泌相关的aa

序列。

为蛋白指明目的地。23第92页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、原核表达系统原核基因表达第93页/共121页九、外源蛋白质表达后的正确修饰分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。1.形成正确的二硫键

第94页/共121页人胰岛素分子第95页/共121页抗体分子人血红蛋白分子第96页/共121页如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。2.前体切割

第97页/共121页（1）O-糖基化（Ser,Thr）增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。3.蛋白质糖基化

糖基第98页/共121页（2）N-糖基化（Asn）Dol：长醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖第99页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、细菌表达载体举例原核基因表达第100页/共121页1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统。（如糖基化、氨基酸修饰等）。十、原核细胞表达的缺陷2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变形、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且其表达量非常低。第101页/共121页3、原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶降解。4、原核细胞没有转录后加工系统，无法识别内含子，故原核细胞无法表达没有加工过的真核基因组。5、重组原核细胞在培养过程中产生的毒素难以排除，污染表达产物，影响产品纯度。第102页/共121页一、原核生物基因表达的特点二、原核表达系统的注意事项三、原核生物基因表达的调控四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位六、影响外源基因表达效率的因素五、几种类型的原核表达载体七、提高表达水平常用的方法九、外源蛋白质表达后的正确修饰十、原核细胞表达的缺陷八、原核表达系统原核基因表达第103页/共121页第104页/共121页

原核生物作为基因表达系统的受体细胞所具有的特点：原核生物大多数为单细胞异养，生长快，代谢易于控制，可通过发酵迅速获得大量基因表达产物。基因组结构简单，便于基因操作和分析。多数原核生物细胞内含有质粒或噬菌体，便于构建相应的表达载体。生理代谢途径及基因表达调控机制比较清楚。不具备真核生物的蛋白质加工系统，表达产物无特定的空间构相。内源蛋白酶会降解表达的外源蛋白，造成表达产物的不稳定。第105页/共121页6.3.1大肠杆菌基因表达系统大肠杆菌——是一种革兰氏阴性细菌，其遗传背景清楚，目标基因表达的水平高，培养周期短。目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是目前应用最广泛的基因表达系统。与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统所具有的优越性：①经过长期研究，人们已经掌握了十分丰富的有关大肠杆菌基础生物学、遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对其基因表达调控的分子机理有了深刻的了解；②大肠杆菌已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体系列；③实验已经证明，许多克隆的真核基因，例如抑制生长素基因和胰岛素基因等，都可以在大肠杆菌细胞中实现有效的、高水平的表达；④大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。第106页/共121页

常见的大肠杆菌表达系统Lac和Tac表达系统：是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。PL和PR表达系统：是以λ噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。T7表达系统：是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统，它具有很高的表达能力。第107页/共121页2芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌——属革兰氏阳性菌，细胞壁不含内毒素，能将表达蛋白分泌到细胞外。目前常用作基因表达系统的有枯草杆菌和短小芽孢杆菌等。利用芽孢杆菌作为表达外源基因的受体菌的优点：许多芽孢杆菌是非致病性微生物，培养条件简单，生长迅速；表达产物能分泌到细胞外的培养基中，且多数表达产物具有天然构相和生物学活性；某些芽孢杆菌的遗传背景比较清楚，便于进行遗传操作；利用芽孢杆菌进行发酵的技术相当成熟。第108页/共121页6.3.2.1芽孢杆菌表达载体复制子金色葡萄球菌的复制子：如pUB110、pC194和pE194等短小芽孢杆菌的复制子：如pHY481和pWT481等含金色葡萄球菌复制子的质粒表达载体在宿主细胞中拷贝数高，但不稳定，原因是质粒载体与宿主染色体DNA之间发生遗传重组。短小芽孢杆菌型复制子的质粒表达载体在宿主细胞中的拷贝数较低，但能稳定存在于宿主细胞中，甚至在没有抗生素选择压力下也不易造成质粒的丢失。第109页/共121页启动子芽孢杆菌含多种转录起始识别因子（σ）。芽孢杆菌启动子的表达具有明显的时序性，它与菌体的生长周期和生理代谢活动密切相关。表达载体自主复制质粒：是一类穿梭质粒，能在大肠杆菌中复制，同时含有能在芽孢杆菌中复制的起始序列，因而也能在芽孢杆菌中进行自主复制。整合质粒：在大肠杆菌质粒基础上构建而成，不含在芽孢杆菌进行复制的起始序列，因而不能在芽孢杆菌中自主复制，但它能插入到宿主染色体并将外源基因和标记基因整合到染色体上，随细胞染色体复制而复制，该方式表达外源基因解决了芽孢杆菌中质粒不能稳定遗传的问题。噬菌体：以芽孢杆菌温和型噬菌体构建的表达载体能将外源基因定位整合到染色体上，并且在合适条件下（温度）诱导外源基因表达。第110页/共121页6.3.2.2宿主菌常用的宿主菌枯草芽孢杆菌短小芽孢杆菌地衣芽孢杆菌第111页/共121页6.3.2.3外源基因在芽孢杆菌中的分泌表达芽孢杆菌的细胞膜不同与大肠杆菌，通常只有一层细胞膜，当分泌型蛋白质跨膜后就进入到培养基中，因此，外源蛋白的表达量可以达到很高的水平，其表达量可达30g/L。6.3.2.4在芽孢杆菌中高效表达外源基因的策略提高表达质粒在细胞中的稳定性灭活芽孢杆菌胞外蛋白酶第112页/共121页6.3.3链霉菌表达系统链霉菌——是一种革兰氏阳性细菌，广泛分布于土壤中