天山雪菊与玛卡细胞组织培养实验方案设计

/天山雪菊、玛卡与人参细胞组织培养实验方案设计实验材料简介天山雪菊生长在海拔2600米以上的雪山之隅及喀喇昆仑山脉。是目前新疆惟一与雪莲齐名，具有独特功效的稀有高寒植物。花瓣呈金黄色，球型花蕊呈棕色，每年八月盛开，花期短促，似昙花一现，生长面积小，生长环境特殊，产量极小，弥足珍贵。性情温和，能够有效地降血压、血脂。最高等级的雪菊是指生长于海拔3000米左右的高寒地区的雪菊，称之为“高寒雪菊”。玛卡maea)是十字花科独行菜属植物，别名甜菜根或秘鲁人参，原产于南美洲安第斯高原。肉质根短圆锥形，外表皮呈紫色、奶油色或黄色，富含碳水化合物、蛋白质、不饱和脂肪酸和矿物质元素，主要化学成分是玛卡烯(Maceaene)、玛卡酰胺(Macamide)、硫配糖体(Glucosinolates)等。玛卡营养丰富，既可入药，又能食用，具有增强人体免疫力、快速恢复体力、消除疲劳等神奇功效，玛卡烯、玛卡酰胺被认为是玛卡提取物中具有促进性功能的有效物质之一。人参是我国名贵中药，堪称当今天然补益药的代表。享有中药之王的美誉，久为世人瞩目，已有两千多年的应用历史。它具有增强免疫力、抗疲劳、保护心肌细胞、抑制细胞凋亡、抗肿瘤、健胃、抗炎、降糖、降脂等多种功效⋯，人参皂苷（ginsenoside，GS)是人参的主要有效成分，现已明确结果的GS单体约有40余种；在人参中的含量在4%左右。目前我国对人参皂苷的提取分离方法、制剂工艺、抗肿瘤作用机制以及临床应用等方面做了大量研究，而且已经有人参皂苷的新产品推向市场。实验背景植物细胞培养至今已对400多种植物进行过研究，从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物(secondarymetabolites)，包括萜类、皂苷、酚类和生物碱等。有的植物细胞培养曾达到工厂化生产的规模。利用植物细胞培养进行有用次级代谢产物的生产之所以倍受关注，是由于它具有不受环境生态条件的限制，且增殖速度比植物通过栽培的快及较容易调控次级代谢产物合成等优点。以往提高植物细胞次级代谢能力的研究大多是对单一种类细胞进行筛选高产细胞系、优化培养条件、改变培养方式、添加诱导子和转基因等技术的研究，最近，有科学家开始尝试利用植物一微生物、植物一植物之间的相生相克特性，通过使用不同物种材料进行共培养来提高植物，特别是药用植物细胞培养效率及其次级代谢产物合成的能力。自然界中微生物与植物、植物与植物之间的相生相克是一种普遍的现象。许多微生物在对植物提供营养或造成侵害的同时能增强其次级代谢过程、增加次级代谢产物的形成，例如有些内生菌能激活苯丙氨酸解氨酶、真菌侵染促进血竭的形成芦’61。反过来植物产生较多的次级代谢产物(酚类和萜类衍生物等)能加强抑制有害微生物的生长。当两种植物在一起生长的时同样会发生彼此促进或抑制的作用。实验概要实验的种子资源玛卡和雪菊都购自新疆和田陆承志处。人参细胞培养材料取自张老师的农杆菌诱导的人参发根。利用基础培养基培养与各种不同的激素等诱导因子培养，探究玛卡和雪菊种子的最佳培养条件。通过培养完整的植株增加实验所需材料的多样性。确定培养条件后在培养基中培养完整植株，记录植株的生长情况。在培养过程中取植株各阶段的各个组织器官做外植体，进行植物细胞愈伤组织的培养。检测其主要具有药用成分的次级代谢的产量情况。一部分进行愈伤组织的传代扩大培养，另一部分做雪菊与人参、玛卡与人参、雪菊与玛卡共培养。研究共培养下药用植物的细胞的生长率与对次级代谢产物的产率提高情况。并进一步研究共培养植物细胞之间的相互影响关系。实验操作步骤玛卡与雪菊种子的实验室培养培养基配制与灭菌配制MS固体培养基2L，分装到16个三角瓶中。与镊子、滤纸、滤斗、蒸馏水一起放入高压灭菌锅中灭菌35min钟。种子消毒处理根据实验要求取雪菊种子100粒、玛卡种子6粒于烧杯中用温水催芽12~24个小时。用2%~2.5%NaClO消毒15min，用蒸馏水清洗3~5次。在种子表面滴加几滴吐温试剂，并搅动种子使吐温试剂均匀分布在种子表面上。在超净工作台上用20%升汞溶液消毒30min钟。将种子转移入滤斗中无菌水清洗3~5次。接种超净工作台下接种10瓶雪菊种子每瓶10粒，3瓶玛卡种子每瓶2粒。放入气候培养箱中培养。培养条件为每天光照16小时，光照强度2500XL，25℃，空气湿度60%培养数天。植物细胞组织的诱导培养取材在培养数周后的雪菊与玛卡植株的根尖与幼芽处取材作为外植体，经过低温下黑暗预处理后。70%乙醇浸泡5min，蒸馏水清洗3~5次。20%升汞消毒30min后无菌水冲洗3~5次。在超净工作台上将根尖与幼芽用小刀切成5cmx5cm大小的小片状外植体。最佳诱导培养基的选取表1.诱导培养基对诱导率的影响MS培养基下各个激素的添加浓度mg/L6-BANAA2,4-D诱导率0.202.00.20.600.402.00.40.600.602.00.60.60配制基础培养基2L，其中液体培养基1L,固体培养基1L。分装培养基，每个三角瓶定量倒入50ml培养基。配制0.5mg/ml的生长调节剂母液，各100ml。根据上表配制诱导培养基每个激素组合配制4瓶，其中固液培养基各两瓶。共48瓶。（具体配置细节见后附表）配置好诱导培养基后，在超净工作台上将处理好的外植体接种到以上培养基中，分别接种两瓶根尖两瓶幼芽进行细胞愈伤组织培养，培养条件在恒温培养箱中25℃下暗培养20d，得出雪菊和玛卡的最佳诱导组合及其浓度。待诱导形成较大块愈伤组织。在做下一步实验的实验材料。愈伤组织的看护培养体系及传代培养看护培养体系的建立待形成较大块愈伤组织后，帅选出诱导效果较好，成黄绿色细胞团的愈伤组织。分成两组，其中一组雪菊或玛卡愈伤组织细胞与人参进行组合式混合共培养，建立雪菊与人参、玛卡与人参、雪菊与玛卡的看护培养的共培养体系。根据第二步实验得出的最佳诱导激素组合配制愈伤组织诱导培养基2L，全部用固体培养基。分装成18瓶与滤纸、镊子一起进行高压蒸汽灭菌。待用。在超近工作台上，将雪菊愈伤组织用镊子转移到共培养的培养基中，放入一张灭菌后的滤纸盖在雪菊愈伤组织上。培养一天待滤纸与愈伤组织交融在一起后，在超净工作台下接种人参细胞于滤纸上，平行试验做3瓶。再以人参为看护组织进行共培养，平行试验3瓶。继续放在25℃下恒温黑暗条件下培养15d。按照雪菊与人参的共培养方法，建立玛卡与人参、玛卡与雪菊的看护培养的相互之间的交错看护培养，一共需要做12瓶。25℃黑暗培养15d。愈伤组织的传代培养根据第二步实验得出的最佳诱导激素组合配制愈伤组织诱导培养基2L，1L固体培养基1L液体培养基。分装成18瓶与滤纸、镊子一起进行高压蒸汽灭菌。待用。在超近工作台上，将雪菊与玛卡的愈伤组织分别用镊子接种到固体和液体培养基上。接种完成，同样放于25℃恒温黑暗培养15d。与看护培养的愈伤组织进行对照比较。并为下一步的实验保留实验材料。4.次级代谢物的提取将培养15d共培养与传代培养的愈伤组织制备样品液。分别测定人参皂苷、玛卡生物碱、雪菊中黄酮与萜烯类物质的含量。人参皂苷的测定预处理：Rootswerewashedwithrunningtapwaterfor2minfollowedbydistilledwater.Afterfilteringundervacuum,rootfreshweightswererecorded,andtheirdryweightsweredeterminedafterdryingat60°Cfor3days.自来水清洗2min后用蒸馏水清洗，真空过滤，称重，60℃干燥三天后称量干重。提取方法：Onegofmilledpowderoffreeze-driedsuspensioncellswassoakedin80%MeOHat60℃180min.TheliquidwasevaporatedandtheresiduedissolvedinH2Oandwashedtwicewithethylether,followedbyextractionwithH2O-saturatedn-butanol.Thebutanollayerwasthenevaporatedtoproduceasaponinfraction.比色法测定人参皂苷的总纯度标准曲线的制备精密称取人参皂苷Re标准品30mg，用甲醇定容至100ml，容量瓶中摇匀备用，分别取上述溶液0.0（空白对照管）、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml。于6只10ml刻度试管内，分别加甲醇0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0ml摇匀在冰水浴中加入8%香草醛乙醇液0.5ml,77%的硫酸5ml,于60水浴中加热10min立即置于冰水浴中冷却15min，以第一只试管溶液为空白对照，在554nm处测定其余5只试管的吸光度（A）以人参皂苷Re浓度为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线含量测定精密称取待测样品30mg,用甲醇定容到100ml容量瓶中精密量取0.3ml于10ml刻度试管中，加0.2ml甲醇，另取10ml刻度试管，加0.5ml甲醇，在冰水浴中向两只试管中同时加入8%香草醛乙醇液0.5ml，77%的硫酸5ml，摇匀60℃水浴中加热10min，冰水浴中15min,在554nm处测定吸光度A，根据标准曲线计算人参皂苷的含量。玛卡生物碱含量的测定玛咖总生物碱提取液的制备将愈伤组织样品捣碎，取1g用甲醇20mL浸泡24h，过滤，取滤液为提取液。同法提取3次，合并提取液、浓缩为浸膏。然后用质量分数2%HCl溶液洗涤溶解，共洗涤3次，合并酸液，5000r/min离心10mim。取酸溶液，用质量分数10%NaOH调至pH10，再用等体积氯仿萃取3次，合并萃取液、浓缩并定容至10mL所得生物碱提取液用60℃水浴蒸干。然后加入5.0mL无水乙醇溶解，加入0.01mol/LH2SO4溶液15mL，甲基红指示液3滴，用0.02mol/LNaOH溶液滴定至黄色。读取消耗的NaOH溶液的量，计算消耗H2SO4的量，并计算总生物碱的含量(每1mLH2SO4溶液相当于4.967mg的苦参碱)。雪菊黄酮类的含量测定在待测物的水溶液中，加入亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠试液，铝离子与黄酮类化合物3，4，（或3，5）二羟基发生络合反应显色来进行测定。黄酮类化合物分子中具有3一羟基、5一羟基或邻二酚羟基，则易于与金属盐类如铝盐、锆盐、锶盐、镁盐等反应，生成有色金属络合物，这些络合物作用在光谱上能产生明显的变化，吸收峰红移。常用于黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al(NO，)，、A1C1，等。A1(NO3)3比色法是一些药典最常用的总黄酮含量检测方法，它主要以A1(NO3)3为显色剂，在碱性条件下，利用其与黄酮形成红色螯合物为特征，以芦丁为对照品，在510nm处测定其吸收度，从而得到待测物质的黄酮含量。NaOH作用就是把体系调成碱性。Al(NO3)3络合物在碱性条件下显色明显。至于NaNO2，可能能提供NO2离子或者起氧化作用。实验结果分析根据测定的各个培养条件下人参皂苷，玛卡生物碱，雪菊黄酮类质的数据。对比共培养与传代培养得到的愈伤组织的有效药用成分含量，分析共培养对三种药用植物愈伤组织的相互影响。探讨相互之间的影响因素。后续实验母液母液成分规定量浓缩倍数称取量（mg）母液体积（ml）配制1升培养基吸取量定容编号种类1大量元素KNO3190010190001000100NH4NO316501016500MgSO4·7H2O370103700KH2PO41701017002CaCl2·2H2O44010440010001003微量元素MnSO4·4H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4·7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有机物甘氨酸2.010010050010盐酸吡哆醇0.510025盐酸硫铵素0.11005烟酸0.5100256肌酸100100500050010母液成分规定量浓缩倍数称取量（mg）母液体积（ml）配制1升培养基吸取量定容编号种类1大量元素KNO3190010190001000100NH4NO316501016500MgSO4·7H2O370103700KH2PO41701017002CaCl2·2H2O44010440010001003微量元素MnSO4·4H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4·7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有机物甘氨酸2.010010050010盐酸吡哆醇0.510025盐酸硫铵素0.11005烟酸0.5100256肌酸100100500050010MS诱导培养基母液的配制注意：1．大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。2．微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后