大学实验报告细菌的培养

PAGE大学实验报告，细菌的培养篇一：培养基的制备与灭菌实验报告陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告报告题目培养基的制备与灭菌姓名刘伟学号专业生物科学批次/层次指导教师学习中心培养基的制备与灭菌一、目的要求1.掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2.掌握培养基的配置原则和方法。3.掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。三、实验材料1.药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤和包装1．玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。2．灭菌前玻璃器皿的包装（1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。（2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约左右，棉花自身长度约1~。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。（二）液体及固体培养基的配制过程1．液体培养基配制（1）称量（假定配制1000ml培养基）按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、g蛋白胨、放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。（2）溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积（1000ml）；如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。（3）调pH调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至pH达。反之，用1mol／LHCl进行调节。2．固体培养基的配制配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂~2％)加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。（三）培养基的分装根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。1．试管的分装取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150mm时，液体培养基可分装至试管高度1／4左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1／5(约3—4mI)，半固体培养基分装量为管高的1／3为宜。2．三角瓶的分装用于振荡培养微生物时，可在250m1用于制作平板培养基用时，可在250m1三角瓶中加入150ml粉(按2％计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。（四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。1．试管棉塞的制作制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的团孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞．然后直接压入试管或三角瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉塞。制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2／3在试管内，1／3在试管外。目前也有采用硅胶塞代替棉塞直接盖在试管口上。将装好培养基并塞好棉塞或硅胶塞的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用记号笔注明培养基名称及配制日期，灭菌待用。2．三角瓶棉塞制作通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上，目前也有采用硅胶塞直接盖在瓶口上。在装好培养基并塞好棉塞或包扎八层纱布或盖好硅胶塞的三角瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。（五）培养基的灭菌将上述培养基以，l21℃，20min高压蒸气灭菌。灭菌过程：1.加水：首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。2.装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。3.加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气，并打开排气阀。4.排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽一起从排气孔中排出。一般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。5.升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。6.保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所需的时间。如本实验中采用，℃，20分钟灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。7.降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力一定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。（六）斜面和平板的制作1．斜面的制作将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面。斜面长度不超过试管长度l／2为宜。如制作半团体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至凝固。2．平板的制作将装在三角瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿三角瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10~15mL培养基，迅速盖好皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板。（七）培养基的灭菌检查灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好取出1~2管(瓶)，置于37℃温箱中培养1~2天，确定无菌后方可使用。篇二：实验报告XX细菌总数大学活动场所室内环境细菌密度测定实验成员：罗小青、施俊译、上官玉虎、叶紫宇、徐丹丹1、目的：了解在校学生主要活动场所室内环境细菌密度情况，提高学生对自己环境卫生意识，同时锻炼学生的实际操作能力。2、方法：该测定有两种方法，其一是撞击法，它是通过抽气动力作用，使空气通过狭缝或小孔而产生高速气流，从而使悬浮在空气中的带菌粒子撞击到培养琼脂平板上，经37℃、48h培养后，计算每立方米空气中所含的细菌菌落数的采样测定方法。另一种方法是自然沉降法，即采样法，它是在直径9cm的营养琼脂平板在采样点暴露5min，或更多暴露时间进行分析，再经37℃、48h培养后，计算生长的细菌菌落数的采集测定方法。由于设备的不完全，该细菌测定方法采用采样法。3、仪器和设备高压蒸汽灭菌器恒温培养箱个培养皿（直径90mm）锥形瓶试纸酒精灯4培养基营养琼脂培养基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15~20g蒸馏水1000mL制法：将上述各成分混合，加以溶解，校正PH至，过滤分装，在121℃20min高压灭菌，用自然沉降法测定时，倾注15mL于培养皿中，制成营养琼脂平板。5操作步骤设置采样点时，应根据现场的大小，选择有代表性的位置作为空气细菌检测的采样点，通常设置5个采样点，高度为~。采样点应远离墙壁1m以上，并避开空调、门窗等空气流通处，本实验选择了食堂、宿舍作为实验场所，其中采样宿舍位于食堂旁边的六楼，也是我们队员男生生活的地方（四人间），通过我们生活场所来反映我们学校学生宿舍的环境情况，其采样布置点为阳台、床铺旁、书桌、门口和卫生间。采样食堂位于人比较密集的地方，以更准确的反映食堂卫生环境，其采样布置为收餐台、台子、门口、洗碗池和窗户。将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5min盖上皿盖，翻转平板，置36℃±1℃恒温箱中，培养48h计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，以每平皿菌落数（CFU/皿）报告结果。实验主要步骤如下图所示：6结果分析菌落生长情况如图：结果计算与分析：宿舍对应的数据如下：食堂对应的数据如下：数据分析：我校某宿舍平均菌落数为(CFU/皿)，依据《室内空气质量标准》GB/T18883-2002卫生标准：按奥梅梁斯基氏计算法：在面积为100cm2的培养基表面，5min沉降下来的细菌数相当于10L空气中所含的细菌数。100cm2培养基的菌落数=每块平板数÷πr2×100=(CFU)，1m细菌数=10*1000=8069(CFU)，远大于室内标准，说明了该宿舍空气质量3比较差，所以在我们生活当中应常开窗，保持空气对流，同时要定时打扫卫生，使我们生活得更加舒适。对于食堂而言，我们可以看到上图细菌生长情况，有的无法计数（太多），这也说明了该场所的细菌比较多，依据《饭馆、餐厅卫生标准》GB16153-1996卫生标准：远超过标准，食堂其实是我们在学校一日三餐、人流通密度大的重要公共场所，对我们身心健康影响重大，为提高食堂空气质量，应对其场所常开窗（方便而重要的方法），保持空气对流，吃饭时应养成洗手的好习惯等等。参考文献：1、环境工程微生物学（周群英、王士芬编著）2、公共场所空气中细菌总数的测定3、《室内空气质量标准》GB/T、《饭馆、餐厅卫生标准》GB16153-19965、刘国强,周娅.校园空气污染微生物的检测与评价[J].微生物学杂志,2004(3):56-58.篇三：浙大微生物大实验报告摘要：本实验以土壤中的微生物作为原材料，根据微生物各自的生长特点，配制不同成分的微生物培养基。将微生物培养物或含有微生物的样品在无菌条件下移植到培养基上培养，在分离出相应微生物后，对其进行进一步的纯化，然后观察其形态特征，并通过微生物的生理生化反应对其种类进行鉴定，最后研究环境条件对微生物生长的影响。关键字：培养基，分离，纯化，鉴定，环境条件一、实验材料1、分离细菌、真菌、放线菌的材料：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O等。新鲜土壤；培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL装）；试剂：5000U/mL链霉素液、％重铅酸钾液。2、细菌、真菌、放线菌纯化与鉴定的材料：菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、荧光假单胞菌、金黄色葡萄球菌，前实验分离的未知菌；培养基：淀粉培养基、硫化氢实验培养基、石蕊牛乳培养基、油脂培养基；试剂：碘液。菌种：枯草杆菌斜面；灵杆菌菌液；黑曲霉斜面。培养基采用：牛肉膏蛋白胨斜面培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（10mL）、马铃薯蔗糖培养基（10mL）、淀粉琼脂培养基（10mL）；供试药剂：％碘酒，75％酒精，％HgCl2，5％石炭酸。二、实验步骤1、分离细菌、真菌、放线菌的步骤（一）、培养基配制l.培养基配制的一般方法和步骤（1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于搪瓷杯中。（2）溶化：在搪瓷杯中加入所需水量（根据实验需要加入蒸馏水或自来水），用玻棒搅匀，加热溶解。（3）调pH值（调pH也可以在加琼脂后再调），用1NNaOH或1NHCl调pH，用pH试纸对照。（4）加琼脂溶化，在琼脂溶化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦，待完全溶化后，补足所失水分，一般数量少，时间短不必补水。（5）分装：在漏斗架上分装。根据不同的需要进行分装，一般制斜面的装置为管高的1／5特别注意不要使培养基粘污在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。（6）包扎成捆、挂上标签。培养基分装好后，塞上棉塞，用防水纸包扎成捆挂上所配培养基名称的标签。（7）灭菌备用。灭菌后如需制成斜面的，应在下磅后取出，摆成斜面（见图6-1）。培养基经灭菌后，必须放在37℃恒温培养箱中培养24h，如确无菌生长、方可使用。2．三种培养基的配方及具体配制方法（1）.牛肉膏蛋白陈琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）。配方：牛肉膏3g琼脂20g灭菌／cm2，25~30min蛋白胨5g自来水1000mL氯化钠3g~本实验将原配方配成各种浓缩液。各种浓度如下：30％牛肉膏、50％蛋白胨、30％氯化钠。以配制200mL培养基为例。吸取30％牛肉膏2mL；50％蛋白胨2mL；30％氯化钠2mL；加入有刻度的搪瓷烧杯中，然后用自来水补足到200mL。用玻棒搅匀，在电炉上稍加热，调pH至，加琼脂4g，加热熔化，用玻棒不断搅拌，至琼脂完全溶解为止，趁热在漏斗架上装试管，（见图6－2）。装带有棉塞的无菌试管，装置1／5的试管高度共12支，作斜面培养基、用铝壳试管帽的里装10mL。约试管高度的1／2以上，用作分离时倒平板用。分装完毕，以12支为一捆，用防水纸包扎成捆（图6-3），挂上标签，灭菌备用。（2）.马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基）。配方：去皮马铃薯（或鲜豆芽）200g蔗糖（或葡萄糖）20g琼脂20gpH天然自来水1000mL灭菌（含蔗糖）cm220min（含葡萄糖）cm230min制备方法配制200mL培养基为例取上皮马铃薯40g，切成小块、放入无刻度的搪瓷杯中，加水200mL，置电炉上加热煮沸10min，用4层纱布过滤至具刻度的搪瓷杯中，滤液加水补足至200mL。然后加蔗糖4g，加琼脂4g，加热熔化并用玻棒不断搅拌直至琼脂完全溶化分装试管，下面一系例步骤同配细菌培养基相同。（3）.淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause’I），用干分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方：可溶性淀粉MgSO4·7H2ONaClK2HPO4FeSO4·7H2O琼脂20g自来水1000mL灭菌cm230min制备方法配制（以配制200mL）培养基为例：吸取配方液：1％KNO320mL；1％K2HPO410mL；1％MgSO4·7H2O10mL；l％NaCl10mL；1％FeSO4．加水补足至200mL，置电炉上加热.用另一只搪瓷杯称取可溶性淀粉4g，从200mL中取出少量加入淀粉中，用玻棒调成糊状，待液体沸腾后将淀粉糊洗入培养液中，搅匀，调pH至，加琼脂4g，加热至琼脂完全溶化为止，趁热分装试管，以下一系例步骤同于配制细菌培养基的操作方法。3.无菌水的制备无菌水，为下一次微生物分离实验中所需用而准备。100mL三角瓶（装有玻璃珠），装自来水45mL，试管中装9mL自来水，塞上棉塞，包扎灭菌备用。三角瓶和试管须预先塞好棉塞，并经干热灭菌。（二）分离培养微生物常用器皿的准备1.清洗一些玻璃仪器：如三角瓶试管，培养皿、吸管等。2.棉塞的制作：装培养基和分离培养需用的部分玻璃器皿，需加棉花塞梯塞的作用为过滤空气，使试管内外空气可以流通，但外界空气中杂菌不能进入，避免污染、试管、三角瓶都要做棉塞。吸管上部也要塞入棉花，在管口约1-2mm处，用解剖针塞入少许棉花，（约长）以防止细菌吸入口中，井避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞得松紧适宜。吹时以能通气但不使棉花塞下滑为准。3.包装培养皿和吸管等。为了使培养皿、吸管、三角玻棒等洗净，干热灭菌后，不让表面暴露，以保证无菌状态，为此干热灭菌前先用旧报纸包装妥当（见示范），每组同学包培养皿6只（一包）。吸管的包装，将塞好棉花的吸管尖端，放在4~5cm宽的长纸条的一端，约成45°角左右，折叠纸条，包住吸管尖部，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。（三）微生物的分离1.用稀释平板法（又名混菌法）从土壤中分离真菌。（1）制备土壤稀释液无菌操作过程见教师示范。A.取土壤5g，放入装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10-1的土壤悬液。B.另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10’的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。同法由10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，依次连续稀释至10-4、10-5、10-6土壤稀释液。在土壤稀释过程中，以用一支吸管由浓到稀，稀释到底，稀释方法见图7-1。图7－1检样的稀释方法（2）每组取无菌培养皿2付，即每个同学做一只。学号单号学生用10-5稀释度液，双号学生用10-4稀释度液。①先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。②取另一吸管，以无菌操作法吸取10-4或10-5土壤稀释液1mL，加在无菌培养皿的一边，在皿的另一边加入2滴5000U/mL的链霉素液。此时严防两液相混。③取已融化在水浴锅中保温50oC左右的马铃薯蔗糖琼脂培养基2管（10mL装，一管倒一皿），以不烫手为准，倒入上述培养皿中（见图7-2），轻轻转动培养皿，使菌液、链霉素液、培养基充分混匀铺平皿底，放在平坦的桌面上，凝固后，翻转培养血，置28～30oC恒温培养养5~6d。观察真菌菌落形态以及计数菌落数。并计算出每1g土壤中真菌的数量。即用某一培养皿内真菌的菌落数乘以该培养皿接种液的稀释倍数即得。（3）挑取单个菌落接种到外面培养基上作纯化和性能测定，若不纯，需要继续分离。2.用平板涂抹法分离土壤中的放线菌（土壤稀释液制备同上）。①每组取无菌培养皿2付（每个同学各做一只）。各在培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。②以无菌操作法先在培养皿中加入％重铅酸钾溶液2滴，取已融化的淀粉琼脂培养基2管，分别倒入2付培养皿中，轻轻转动培养皿，使培养基与重铅酸钾充分混匀，铺平，制成平板。③待平板凝固后，另取一支吸管吸取10-3（单学号学生）或10-4（双学号学生）稀释液土壤稀释液放在平板上