分子遗传学基因突变与重组详解演示文稿

分子遗传学基因突变与重组详解演示文稿1当前1页，总共161页。优选分子遗传学基因突变与重组2当前2页，总共161页。3当前3页，总共161页。4当前4页，总共161页。5当前5页，总共161页。6当前6页，总共161页。7当前7页，总共161页。2倍体和4倍体葡萄的比较8当前8页，总共161页。缺失部分染色体9当前9页，总共161页。10当前10页，总共161页。11当前11页，总共161页。12当前12页，总共161页。13当前13页，总共161页。7.2点突变的类型

7.3突变发生的机理(自发突变，诱发突变)7.4保证生物体遗传稳定性的机制7.5基因重组交换的分子机制7.1有关突变的基本概念主要内容14当前14页，总共161页。7.1有关突变的基本概念突变(mutation)：可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。突变是一种遗传状态，是相对于正常状态而言突变体(mutant)：携带突变基因的生物个体或群体遗传突变：包括核苷酸点突变和染色体突变（染色体数目和染色体结构的改变)点突变：在一个基因内部发生的一个或数个核苷酸对的增加、缺失或取代，称为点突变15当前15页，总共161页。表示方法表现型Arg+Arg-基因型arg+

arg-

野生型正性状突变基因(mutantgene):存在突变位点的基因野生型基因（wildtypegene）：没有发生突变的基因16当前16页，总共161页。基因突变的时期突变可以发生在生物个体发育的任何时期，性细胞发生的突变可以通过受精直接传递给后代显性突变：aA当代表现隐性突变：Aa当代不表现17当前17页，总共161页。体细胞如果发生突变，突变的体细胞在生长过程中，往往竞争不过周围的正常细胞，受到抑制或最终消失保留体细胞的突变，需将它从母体上及时分割下来加以无性繁殖，许多植物的突变就是体细胞的突变结果。如果果树上一旦发生优良突变，即可直接采用无性繁殖方法育成新品种18当前18页，总共161页。19当前19页，总共161页。20当前20页，总共161页。21当前21页，总共161页。22当前22页，总共161页。（1）取代(conversion)转换(transition)

PyPy

Pu

Pu

颠换(transversion)

Py

Pu

7.2.1点突变的种类

7.2点突变的类型１．转换（transition）：指ＤＮＡ分子中的嘌呤为另一种嘌呤或嘧啶为另一种嘧啶所取代而引起的突变。２．颠换（transversion）:指DNA分子中的嘌呤被嘧啶取代或嘧啶被嘌呤取代所引起的突变。23当前23页，总共161页。转换24当前24页，总共161页。颠换25当前25页，总共161页。转换和颠换的相互关系示意图26当前26页，总共161页。（2）核苷酸缺失突变或插入突变

=3xdNt

±nxAminoacid对蛋白质结构的影响较小

=3xdNt

Frameshift(移框突变)改变了氨基酸的组成，也会出现蛋白质合成过早终止移码突变（frameshiftmutation）：指ＤＮＡ分子中插入或缺失一个或少数几个核苷酸，使整个阅读框改变而引起的突变。27当前27页，总共161页。Examplesofdeletionmutations

28当前28页，总共161页。7.2.2碱基取代的效应从对遗传信息的改变上同义突变(synonymousmut.)：指没有改变产物氨基酸序列的密码子的变化，与密码子的简并性有关。GAA(Glu)→GAG(Glu)

错义突变(Missensemut.)：指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变。GAA(Glu)→AAA(Lys)

无义突变(Nonsensemut.)：指某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子。产物一般没有活性。

AAG(Lys)→UAG(stop)

无义突变类型UAA（Oc）赭石型（Ocher）UAG（Am）琥珀型（amber）UGA（Opal）乳石型（Opal）29当前29页，总共161页。(４)延长突变（elongationmutation）：这是一类刚好与无义突变相反的突变，是由于终止密码子突变为编码子，使肽链延长。

30当前30页，总共161页。获得突变型是遗传学研究的重要前提

非条件型突变；

alleleinDNAlevel(RFLP,RAPD…)

alleleinphenotyle(红花/白花，糯/非糯…)

条件型突变；

突变的表现=突变基因型+诱导条件

（光，温敏感不育，Ts,su--…）

7.2.3突变的表达类型

有些基因突变的结果在正常生长情况下表型没有明显的改变，但在特定条件下可以表现为不同程度的改变甚至死亡31当前31页，总共161页。32当前32页，总共161页。7.3.1自发突变

（1）碱基异构式替代正常碱基引起DNA复制过程错误

a)碱基异构式

A(amino)A(imino)

C(a)C(i)

G(keto)G(enol)

G(k)

G(e,i)

T(keto)

T(enol-2’)orT(enol-4’)

在细胞内某些因素的作用下即可发生。突变的频率平均为每一核苷酸每一世代10－9～10－107.3突变发生的机理(自发突变，诱发突变)

33当前33页，总共161页。b)碱基异构式引起DNA复制的错配

G(k)C(a)

正确配对A(a)T(k)

错误配对G(k)T(e)

A(a)

C(i)

A(i,anti)A(a,syn)A(i,anti)G(k,syn)

G(e,i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)A(a,syn)

A(i)

C(a)

G(e)

T(k)

34当前34页，总共161页。A(a)

T(k)

A(a,anti)

T(k,anti)

C(i)

C(a,anti)

A(a)

A(a,anti)

碱基异构式引起DNA的错配突变

C(i)

C(a)G(k,syn)

G(k,syn)

G(k,anti)G(k)35当前35页，总共161页。（2）重复序列间的非对等（不对称）交换

（3）增变基因（mutatorgene）

生物体内有些基因与整个基因组的突变率直接相关。当这些基因突变时，整个基因组的突变率明显上升，这些基因称为增变基因增变基因类别DNApolymerase相关基因3’5’editingfunctionmutation错配修复系统的基因MCE(mismatchcorrectionenzyme)DNA

损伤修复系统基因错配，修复功能丧失突变率升高36当前36页，总共161页。7.3.2诱发突变

（1）物理诱变

a)电离辐射诱变

Co60(χ)(γ)ray

Cs137(χ)(γ)ray

H3(α)ray

P32,,S35(β)ray

卫星搭载诱变；

高真空，强辐射，微重力

(χ)(γ)ray穿透性

（外照射处理）

(α)(β)ray非穿透性

（内标记处理）

dNt电荷及结构改变

导致DNA的断裂、错接及碱基配对关系的改变37当前37页，总共161页。电离辐射诱变的作用规律辐射剂量的表示方法：X射线、γ射线：伦琴(R)；中子：积分流量(n/cm2)；β射线：微居里(μcu/g)。突变率与辐射剂量：突变率与辐射总剂量成正比；突变率与剂量率(辐射强度的影响)无关。38当前38页，总共161页。b)非电离辐射—UltraVioletlight(U.V)大剂量的UV照射；相邻的两个T或两个C或C和T之间均可以形成嘧啶二聚体，最容易形成的是TT二聚体在人皮肤中，每小时由于UV而产生嘧啶二聚体的频率为5×104／细胞UV因穿透力有限，对于人的作用仅限于皮肤，但可以影响微生物的存活39当前39页，总共161页。pyrimidinedimer(TTdimer)isgeneratedbycovalentlinks

betweenadjacentTT

∧U.V.…CTTA…环丁基嘧啶二聚体40当前40页，总共161页。主要是紫外线：紫外线的作用机制：激发作用：T-T，CU；穿透能力与处理方法：微生物或植物配子最有效波长260nm(嘌呤、嘧啶的共轭环)间接诱变作用：培养基内H2O2的产生；物理诱变的非专性：对DNA分子及其核苷酸残基无选择性，所以没有专化性和特异性。脱氨41当前41页，总共161页。42当前42页，总共161页。（2）生物技术定点诱变（3）化学诱变（4）转座子和Ti质粒介导的插入突变1.提高基因突变率；2.获得更丰富的突变类型；3.改良生物的个别性状。应用43当前43页，总共161页。(5-BrU,5-溴尿嘧啶)酮式烯醇式Kea)碱基类似物在DNA复制时的渗入造成碱基错误配对（3）化学诱变44当前44页，总共161页。5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)ATGCreplicationerrorA/T

G/Cincorporationerror渗入错误G/CA/TAGReplication45当前45页，总共161页。A(a)T(k)5-BrU(k)G(k)5-BrU(e)C(a)mispairingmispairingT(k)A(a)5-BrU(k)G(k)C(e)5-BrU(e)A(a)G(k)G(k)A(a)ReplicationerrorIncorporationerror5-BrU(k)5-BrU(e)46当前46页，总共161页。5-BrU(k)

5-BrU(e)ReplicationBrU(k)BrU(e)GCreplicationerrorA/T

G/CincorporationerrorG/CA/TInDNABrU(k)>BrU(e)(normal)(isoform)BrU(k)

BrU(e)难易AGGATCCT>47当前47页，总共161页。HNO2(NitrousacidNA)引起氧化脱氨反应,氨基变为酮基b)DNA分子上碱基的化学修饰导致碱基错误配对ACGInosineCUracilAXanthineCdeamination

HNO2黄嘌呤次黄嘌呤48当前48页，总共161页。ATHNO2ITICGC复制复制ATGC转换49当前49页，总共161页。

DNA分子上碱基的化学修饰导致碱基错误配对C(i)A(a)HNHHOC(a)HAHNHHHOHNHHOHNHHOHNHHONHNH2OH(HydroxylamineHA羟胺)对C具有专化性，使其转变为羟胺胞嘧啶。并特异地诱发G•CA•T50当前50页，总共161页。GCNH2OHGChACh复制复制GCAT转换AT51当前51页，总共161页。烷基化试剂的致突变作用EMS(甲磺酸乙酯Ethylmethanesulfanate)CH3—S—O--CH2CH3OOMMSCH3—S—O--CH3OOSM(SulfurMustardsgas硫芥子气)HSCH2CH2ClCH2CH2Cl52当前52页，总共161页。诱变效应:使碱基多处发生烷化，导致DNA结构变异烷基化位点主要在G的N-7位和A的N-3位，A的N-7位也可以烷基化。烷基化的结果有两种：一是使G不再与C配对，而与T配对，造成G•CA•T的转换GCG(7)T烷基化复制AT53当前53页，总共161页。GCG*C烷基化去嘌呤C第二轮复制GCAT和TACG和转换颠换二是减弱N9位上的N-糖苷键，产生去嘌呤作用。大部分无嘌呤位点都可以被无嘌呤内切酶系统修复，但有时复制在修复之前进行，则在无碱基的位置上可以插入任何一个碱基，在第二轮复制之后，G•C对可以变为任何碱基对G•C，C•G，A•T，T•A，既有转换又有颠换54当前54页，总共161页。c)嵌合剂的致突变作用AO(吖啶橙AcridineOrange)扁平分子EB(溴化乙锭EthidiumBromide)嵌合剂的分子大小与DNA的碱基对大小差不多，可以嵌合到DNA的碱基对之间，原来相邻的两个碱基对分开一定的距离，含有嵌合剂的DNA在下一轮复制时，可以随机插入一个碱基，偶尔也有两个（插入突变）。有时发生很低频率的单碱基缺失突变，这些突变都会引起阅读框的改变。55当前55页，总共161页。TACGAATCGGGTATTATGCTTAGCCCATAATACGAATCGGGTATTATGCTTAGCCCATAACG染料分子嵌入复制插入一个碱基对移码突变56当前56页，总共161页。插入分子引起移码突变57当前57页，总共161页。58当前58页，总共161页。7.3.3突变热点(hotspotofmutation)任何一种生物的各个基因自发突变的频率是一定的不同基因DNA序列不同形成特定排列的突变热点频率不同玉米R粒色I色素抑制基因Pr紫色Su非甜Y黄色子粒Sh饱满子粒492×10-6106×10-611×10-62.4×10-62.2×10-61.2×10-659当前59页，总共161页。a)m5C5-甲基胞嘧啶的存在是突变热点形成的最主要原因U（突变率很低）（可以被尿嘧啶糖基酶系统修复）C

deaminationm5CTdeaminationG若发生在模板链上，很快引起突变；若发生在DNA复制期间的新生链上，可被错配修复系统修复；若发生在DNA非复制期，由于DNA两条链的甲基化程度相同，错配修复系统失去判别标准，只能随机的切除一个，因此有一半的可能性发生突变。60当前60页，总共161页。b)DNA中的repetitiveseq./palindromicseq.e.g.Lac.OperonCTGGCTGGCTGG复制时，模板链与新生链间滑动错配CTGG序列的缺失突变或插入突变61当前61页，总共161页。为了保证遗传信息的高度稳定性，生物体在进化过程中形成了一系列多步骤的修复机制：（1）纠正偶然的复制错误的系统，如DNA聚合酶的3’5’的校对功能；尿嘧啶糖基酶修复系统；错配修复系统（2）能修复环境因素（如射线）和体内化学物质造成的DNA分子损伤的系统，如光复活修复系统、切除修复系统、重组修复系统、SOS修复系统等（3）对付外源DNA的入侵：限制－修饰系统（4）基因的回复突变（5）致死突变（6）密码的简并（7）多倍体……7.4生物体保证遗传稳定性的机制62当前62页，总共161页。7.4.1复制过程中的错配修复机制(ξ=10-11)主要作用于复制过程中和复制完成后的较短时间内，所要修复的错误碱基已经存在于新生DNA链的内部，称为复制修复（1）错配修复系统(Mismatchrepairsystem)DNA聚合酶将极少数错误碱基遗留在DNA链上而未进行纠正的频率为10－8即108个碱基中有一个碱基是不配对的错误碱基；实际测得的突变频率为10－10或10－11由于DNA的完整性和精确性是生命的根本所在，因而在细胞中演化出另一个修复系统叫错配修复系统，给予第二次纠正错误的机会63当前63页，总共161页。腺嘌呤的的甲基化是错配修复系统的识别标志，这一标志有三个特征：在DNA中，天然的甲基化碱基有两种，N6-甲基腺嘌呤(m6A)和5－甲基胞嘧啶(m5C)，m5C与识别无关。（1）具有碱基序列特异性，m6A一般包含在GATC序列中（2）沿新生DNA链有一个甲基化的梯度，靠近复制叉处的甲基化程度最小（3）亲本链上的甲基化程度高而且均一根据以上特征，此系统就可以识别模板链和新生链，从而纠正新生链上的错配碱基错配修复系统受甲基化的引导64当前64页，总共161页。（1）错配修复系统(Mismatchrepairsystem)DNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme,错配校正酶)由3subunits

mutH,L,S组成Scanning新生链中错配碱基识别新生链中未m6A的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段H亚基L亚基S亚基65当前65页，总共161页。MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.3’

-CCTAGCTAG

5’5’TGATCGATC

3’3’5’少梯度多（m6A）新生链66当前66页，总共161页。MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATC

GATCCTAGCTAGTCGATC

GATCCTAGCTAGTGATC

GATCCTAGCTAGTA67当前67页，总共161页。（2）ungsystem(尿嘧啶-N-糖基酶系统)尿嘧啶有两种来源：(1)生物体内自身存在的U，生物体内有dUTPase，但仍有少数的dUTP渗入DNA链中，发生A•U配对，DNA聚合酶III的校对功能无法识别它。(2)细胞内C脱氨氧化生成的U。两种来源的U都可以通过该系统进行修复包括尿嘧啶－N－糖基酶AP内切核酸酶（无嘌呤内切核酸酶）DNA聚合酶DNA连接酶尿嘧啶－N－糖基酶：能准确识别新生链中的U，并将其切除无嘌呤内切核酸酶：切除邻近核苷酸形成缺口68当前68页，总共161页。（2）ungsystem(尿嘧啶-N-糖基酶系统)TAGCATCGTAGCA

CGUTAGCung-aseGCUAUTAGCACGApurinase(内切酶)TAGCATCGDNApolligase69当前69页，总共161页。7.4.2DNA的损伤修复机制造成DNA损伤的因素电离辐射紫外线烷化剂氧化剂…损伤类型胸腺嘧啶二聚体研究得最清楚当有胸腺嘧啶二聚体的DNA作为模板进行复制时，DNA聚合酶将两个A聚合上去，但由于不能很好地形成氢键，由3’5’的校对功能将之水解。此事件反复发生，从而造成空耗，即大量的的dATP被分解，而DNA复制则毫无进展。由于蛋白质在不断合成，而DNA不能合成，因此细胞不能分裂，出现细丝状的所谓蛇形细胞，最后导致细胞死亡。70当前70页，总共161页。一、嘧啶二聚体的产生类型：TT二聚体（）、CC二聚体（）、CT二聚体（）TTCCCT相邻的胸腺嘧啶胸腺嘧啶二聚体CCCCCCCC71当前71页，总共161页。对于胸腺嘧啶二聚体主要有5种修复途径：

(1)光修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复(5)二聚体糖基酶修复72当前72页，总共161页。phR471aa（1）光修复TTAATT-AATTAATT-AA

发生在DNA复制前；无误修复

400nmBluelight&phRgene(photo-reactivationenzyme，光复活酶，471aa)可见光激活光复活酶已在细菌、酵母菌、原生动物、藻类、蛙、鸟类、哺乳动物中的有袋类以及人的淋巴细胞和皮肤成纤维细胞中发现此修复功能主要是低等生物的一种修复方式73当前73页，总共161页。(2)切除修复广泛存在于原核生物和真核生物中，也是人类的主要修复方式人类的色素性干皮病是由常染色体上的隐性基因控制的一种稀有遗传疾病。患者对阳光极为敏感，皮肤癌的发病率很高原因：切除修复系统失去功能发生在复制前无误修复UvrA,B,Cgene

Endonucleases(核酸内切酶)Exonuclease(核酸外切酶)DNApolLigase74当前74页，总共161页。切割删除切除修复75当前75页，总共161页。核苷酸切除修复76当前76页，总共161页。E.coli存活%U.V剂量w.t.UvrA+RecA+RecA+

uvra-reca-uvra-Rec-Agene以某种方式参与DNA损伤修复(3)重组修复77当前77页，总共161页。★Rec-A.gene以某种方式参与DNA损伤修复♦Rec修复系统比切除修复系统更有效

目前知道

♫Uvr系统负责切除二聚体♫Rec系统负责消除没有被切除的二聚体可能造成的后果78当前78页，总共161页。发生在复制后；易错修复重组修复负责消除那些未被切除的二聚体可能造成的可怕后果在重组修复过程中，二聚体并未除去，而是经过多次复制后，二聚体被稀释，不妨碍正常代谢所需酶在正常的细胞中就存在：

RecA、RecBCD蛋白；DNApolymerase；ligaseRecA蛋白具有催化DNA分子之间的同源联会和交换单链的功能79当前79页，总共161页。RecombinativeRepair(strandtransferrepair)复制修复过程：含有二聚体的损伤DNA仍能复制，但子代DNA链在损伤的对应部位出现缺口，通过DNA分子间的重组，从完整的亲代链上把具有相应碱基序列的片段转到子链的缺口处，然后再聚合核苷酸填补亲代链的缺口80当前80页，总共161页。发生在复制后；易错修复SOS修复系统的存在是紫外线诱发突变的主要原因SOS修复是一种旁路系统，允许新生的DNA链越过TT而生长，代价是保真度的极大降低，是一个错误潜伏的过程其原则是：丧失某些信息而存活总比死亡好当SOS修复系统被活化后，校对系统大大丧失了识别双螺旋结构变形的能力，结束了空耗过程，而使复制继续前进SOS系统的酶只有细胞受到损伤时才出现(4)SOS修复^81当前81页，总共161页。（2）SOS修复机制SOS修复－－无模板指导的DNA复制大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生SOS系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行错误碱基82当前82页，总共161页。SOS修复系统涉及的2个基因：

recA：编码RecA蛋白，该蛋白具有三种主要的生物化学活性：一是重组活性；二是单链DNA结合活性；三是蛋白酶活性。在细胞内，DNA合成正常进行时，RecA蛋白没有蛋白酶活性，只有在DNA受到损伤或DNA复制受抑制时RecA蛋白才有活性。RecA蛋白在细胞中有少量存在

lexA：编码LexA蛋白，是一种阻遏蛋白。该蛋白结合在SOS系统中各基因的操作子上，阻遏SOS基因的活性83当前83页，总共161页。300XDNAdamagedSignal单链DNA、寡聚核苷酸RecAcleavesLexASOSUmuCmutationBeforeinducing.LexA-pRec-A,UmuC…11genesNeg.repressionU.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)RecA高效表达目的基因表达目的基因被LexA阻遏lexA基因被LexA蛋白部分阻遏recA被LexA蛋白部分阻遏lexA表达但产物无活性机制正常生理状态当DNA的损伤被修复，DNA的复制难关渡过后，RecA的高效表达也停止，LexA的负控制机制重新被启动，SOS修复系统关闭。84当前84页，总共161页。RecA在SOS修复反应中起核心作用RecA与LexA组成调控环路DNA损伤SOSRecA受LexA的部分抑制85当前85页，总共161页。当DNA复制受阻/DNAdamaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA-p与S.S.DNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达300timesupSOSopen当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）RecA-p不表现proteinase活性86当前86页，总共161页。当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种error-prone(倾向差错)极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff87当前87页，总共161页。（5）突变的形成DNA未经修复经过修复/校正突变/死亡倾向差错修复(重组修复，SOS）避免差错修复(光修复，切补修复)形成突变不形成突变DNAdamaged/mispairing物理诱变，化学诱变，自发突变是突变发生的前提88当前88页，总共161页。

R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制破坏外源DNA使之迅速降解7.4.3限制与修饰系统

(restrictionandmodificaion)♪菌体限制修饰系统中的限制性内切酶能将外来DNA切断♪菌体本身的DNA可受甲基化酶的保护（m6A、m5C）

两者称为限制-修饰作用89当前89页，总共161页。以大肠杆菌为例，在K株和B株中都含有各自不同的限制――修饰系统，两种不同来源的－噬菌体（lK和lB）长期寄生于各自的宿主细胞中，宿主细胞内的甲基化酶已将其染色体DNA和噬菌体DNA特异性的保护，封闭了自身所产生的限制性核酸内切酶的识别位点，故它们在感染相应的宿主细胞（K株和B株）时DNA不被降解，因此感染频率很高。当它们分别感染其他宿主细胞时，由于没有特异性的保护作用，入侵的DNA分子被宿主细胞的限制性内切酶切割降解，从而感染频率急剧下降，普遍能低一或几个数量极。

90当前90页，总共161页。修饰的(B)大肠杆菌B限制作用(10-4)限制作用(10-4)大肠杆菌K

修饰的(K)11大肠杆菌寄主控制的限制修饰系统数字是生长在不同寄主中的噬菌体的成斑率细菌借助限制－修饰系统区别自己的DNA和外源DNA91当前91页，总共161页。自己DNA:限制模式相同的DNA同株系的不同个体DNA、寄生于其中的质粒和噬菌体居民DNA(residentDNA)：同一个细胞内的不同类型的DNA包括细胞DNA，质粒DNA，噬菌体DNA等92当前92页，总共161页。(2)细菌中三种不同类型的限制修饰酶目前已经鉴定出有三种不同类型的核酸内切限制酶，即I型酶、II型酶和III酶。II型酶由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的，而且核酸内切酶作用又具有序列特异性，所以在基因克隆中有特别广泛的用途。限制性内切酶：准确裁剪DNA分子的工具93当前93页，总共161页。II类限制性核酸内切酶是Smith等人于1968年在流感嗜血杆菌d型菌株中发现的。该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组实验中广泛使用。

目前已分离出400余种II类限制性核酸内切酶，鉴定识别及切割位点的有300多种，商品化的酶NEB（NewEnglandBiolabs）公司品种最多，达220余种，其中在DNA重组实验中常用的有20多种。

94当前94页，总共161页。限制性内切酶的类型95当前95页，总共161页。96当前96页，总共161页。II型核酸内切酶的基本特性：绝大多数的II型核酸内切酶都能识别由4～8个核苷酸组成的核苷酸序列（识别序列），识别序列具有回文结构，如EcoRI(5’-GAATTC-3’)、PstI(5’-CTGCAG-3’)等97当前97页，总共161页。98当前98页，总共161页。同裂酶(isoschizomers)：有些II型核酸内切酶的识别位点的序列相同，但切点不一定相同，这些酶称为同裂酶。如：HpaII和MspI是一对同裂酶，靶序列是CCGGHpaII--CCGG--MspI--GGCC--XmaI--C↓CCGGG--SmaI--CCC↓GGG--99当前99页，总共161页。GGATCCCCTAGG同尾末端酶BglIIIBamHIAGATCTTCTAGA

GATCCGATCTAGAGATCCTCTAGG

同尾酶(isocaudamer)：有些II型核酸内切酶作用后产生的DNA粘性末端相同、识别位点的序列不一定相同，这些酶称为同尾酶如BamHI、BclI、BalII、Sau3AI和XhoII100当前100页，总共161页。限制性核酸内切酶在基因工程属常用工具酶，主要用于基因物理图谱的绘制、基因片段的鉴定或获得、用于杂交的DNA探针的制备等，而酶切的条件控制则是非常重要的。101当前101页，总共161页。在DNA的酶切反应中酶切条件是酶切成功的关键，主要影响因素有：

（1）反应温度

常规酶切反应均在37℃进行，但有些酶的最佳反应温度并不是此温度，如SmaI，最适反应温度为30℃，故最好根据所选用的酶确定反应温度。当采用联合酶切进行实验时尤其要注意选择的反应温度是否都满足两者的要求，如果有一个酶的最适温度不符，建议分步酶切

102当前102页，总共161页。（2）缓冲体系

厂商提供的限制性核酸内切酶有其相对应的缓冲液，一般的缓冲液种类为4-10种左右，按盐离子浓度可分为三大类：高盐、中盐和低盐。缓冲液配制为10×的母液，酶切时稀释10倍。常规酶切中均选用最佳缓冲液进行酶切反应，但联合酶切时，根据厂商提供的联合酶切的缓冲液选择表（宝生物工程公司）选择缓冲液或采用万能缓冲液（Promega）

103当前103页，总共161页。3）反应时间

常规酶切反应时间为1.5小时，但可根据酶切对象和酶的用量将保温时间延长2～3小时，有时甚至可以过夜。一般来说，在DNA量固定的前提下，长时间酶切所需的酶量可适当减少，所以在大剂量酶切DNA时，可以考虑酶切过夜。另对特殊实验，如对基因组DNA进行部分酶切，则在酶量投入一定的前提下，减少反应时间降低对DNA切割的程度。

104当前104页，总共161页。（4）加入酶量

在底物（DNA）一定的条件下，酶量投入越多则酶切效果越好。但实验中常常出现酶量加入过多酶切效果却反而差的现象，这主要是酶的储存液中含有50％的甘油，但酶量加入过多，超过酶反应体系的10％时，过多的甘油抑制了限制性内切酶活性。因此，在酶切反应时，酶量的加入原则：不超过反应总体积的10％，在能切开的条件下加入越少越好（可减少酶的Star活性）。105当前105页，总共161页。（5）DNA纯度

在满足上述条件下影响酶切效果的主要因素是DNA的纯度，DNA样品中蛋白含量过高、有机溶剂（苯酚或氯仿）的残留、高浓度的RNA等。另外DNA浓度过高也会导致酶切失败，一般DNA的质量浓度在1mg/ml体系中能取得好的酶切效果。当发生不明原因的酶切失败时，常用的解决方法是采用稀释酶切，即将酶切体系放大（如从15ul-->30ul），将杂质相对浓度稀释，这样不需多增加酶量就能取得较好的酶切效果

106当前106页，总共161页。酶切方式可分为部分酶切与完全酶切：

（1）部分酶切

指的是同一DNA片段上的位点有些被切开而另一些未被切开，此法主要用于基因的克隆。在某些基因内部可能有此酶的切点，用完全酶切进行克隆时难以得到完整基因。部分酶切实施方法：a）在不同的时间从同一个酶反应管中取样终止反应，利用时间控制酶切程度，该方法比较繁琐，不易掌握得恰到好处；b）固定酶切的反应温度和反应时间，控制酶的投入量，一般是在反应管中加入不等量稀释的酶，利用不同酶浓度控制酶切程度，该方法因易控制而被广泛应用。

（2）完全酶切

适用于除目的基因克隆以外的绝大多数DNA操作，例如载体的切割，酶切图谱的制作，基因的鉴定与DNA片段的分离等。

107当前107页，总共161页。在DNA重组实验中，经常会用双酶切（甚至是3个酶切鉴定）鉴定重组子或获得不同粘性末端的DNA片段，而在厂商提供的联合酶切缓冲液表中并不包括所有类型的酶，即使提供了“万能缓冲液”，有些酶的联合酶切也不一定能取得比较好的效果。解决方法：

（1）分步酶切法

对将进行的两种酶的酶切采用分步的方法，即先选择一个酶，采用此酶的最佳反应条件进行酶切，然后选用第二个酶进行最佳反应。此方法通用性较强，联合酶切也比较完全，但较耗时。

（2）

同步酶切法

取两种酶的最佳缓冲液各50％加入到酶切反应体系中，并同时加入两种酶进行反应。特别是对不同厂商提供的酶进行联合酶切时，即可节约时间也可取得比较好的酶切效果。

108当前108页，总共161页。酶切失败的原因及处理办法

酶切失败主要表现为两方面：

（1）不完全酶切甚至是DNA基本未发生酶切；主要原因有：a）缓冲体系不合适，可进行重新酶切；b）酶量加入过多而导致甘油抑制酶活，可将反应体系适当稀释；c）DNA样品杂质含量高，可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切

（2）DNA被降解（不成带状）；主要原因是DNA样品中含有痕量的DNA酶，建议重新抽提除去DNA酶。

109当前109页，总共161页。BamHISacIBamHI/SacI双酶切BamHI/SacI双酶切BamHISacI连接PCR产物

110当前110页，总共161页。7.4.4基因的回复突变（backmutation/reversemutation）(1)回复突变的概念野生型突变体mutation(lowF.)backmutation(verylowF.)(2)抑制突变的概念突变体所失去的野生型性状通过第二次突变得到回复，第二次突变称为回复突变第二点回复突变并没有真正改变正向突变的DNA的碱基序列，只是正向突变的突变效应被抑制了，因此第二点回复突变又称为抑制突变抑制突变分为两类：A.基因内抑制突变(intragenicsuppresor)B.基因间抑制突变(intergenicsuppresor)111当前111页，总共161页。间接抑制突变:不恢复正向突变基因蛋白质产物的功能，而是通过改变其它蛋白质的性质或表达水平而补偿原来突变造成的缺陷，从而恢复野生型

野生表型恢复作用的性质直接抑制突变:通过恢复或部分恢复原来突变基因产物蛋白质的功能而恢复野生表型112当前112页，总共161页。A.基因内抑制突变抑制突变发生在正向突变的基因中错义突变和移框突变都可以被基因内另一位点的突变所抑制由于处于同一基因中，正向突变和抑制突变一般紧密连锁，因此常把基因内抑制突变当成真正的原点回复突变错义突变造成野生型表型的丧失－－部分原因在于影响到蛋白质的空间结构(正负电荷、疏水作用)113当前113页，总共161页。a、静电作用错义突变的基因内抑制突变114当前114页，总共161页。b、疏水作用错义突变的基因内抑制突变115当前115页，总共161页。移框突变的抑制突变(基因内第二点的插入或缺失)116当前116页，总共161页。B.基因间抑制突变正向突变的无义突变、错义突变和移框突变都可以被另一基因上的突变所抑制，这些抑制突变分别称为无义抑制突变、错义抑制突变和移框抑制突变抑制突变发生在tRNA基因或与tRNA功能有关的基因上，这些基因又称为抑制基因抑制tRNA：能抑制正向突变表型的突变了的tRNA抑制tRNA是自发突变或诱发突变的结果，而不是细胞对于无义突变应答的产物。抑制突变发生在正向突变基因外其它的基因中117当前117页，总共161页。在编码蛋白质的基因中，无义突变的发生频率很高，如AAG、CAG、GAG、UCG、UGG、UAC、UAU中任何一个密码子都可以通过一次碱基替代突变而产生无义密码子，使肽链合成提前终止

无义密码子有三种UAG、UAA和UGA，相应的无义抑制突变也有三种：

琥珀型抑制突变：产生识别UAG的抑制tRNA的基因赭石型抑制突变：产生识别UAA的抑制tRNA的基因乳石型抑制突变：产生识别UGA的抑制tRNA的基因a.基因间的无义抑制突变（Nonsensesuppressor）118当前118页，总共161页。a.基因间的无义抑制突变野生型UAG、UGA、UAA－－－三种无义抑制突变赭石型无义抑制tRNA产生的几率很低，且抑制效率很低抑制tRNA对于无义突变的抑制119当前119页，总共161页。AGAUCUArgGlyGGACCUUCUGlyCCUGlyb.基因间的错义抑制突变(Missensesuppressor)Gly抑制tRNA对于错义突变的抑制突变体蛋白质回复突变体蛋白质携带甘氨酸的抑制tRNA识别精氨酸密码子120当前120页，总共161页。c.基因间移框抑制突变总结：基因内和基因间的错义、无义、移框突变均由相应的错义、无义、移框突变抑制121当前121页，总共161页。基因突变基因重组产生新的基因（基因分子结构改变），从而产生新的基因型不产生新的基因（基因分子结构不变），但重组产生新的基因型区别122当前122页，总共161页。7.5.1自然界的DNA分子均是重组体(recombinant)变异是生物进化的重要因素之一生物对环境的适应机制自然选择的重要基础7.5基因重组交换的分子机制123当前123页，总共161页。可遗传的变异突变（点突变，染色体变异）频率低，突变修复遗传重组交换非同源染色体的自由组合同源染色单体间的遗传交换分子克隆和转基因技术(invitro)普遍发生自然界DNA分子均是重组体124当前124页，总共161页。遗传重组定义广义：造成任何基因型变化的基因交流过程，都叫遗传重组狭义：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流根据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求，将重组分为四种类型125当前125页，总共161页。7.5.2遗传重组的类型(1)同源重组（HomologousRecombination）发生在DNA的同源序列间姊妹和非姊妹染色单体的交换；细菌及某些低等真核生物的转化、细菌的转导和接合、噬菌体的重组；要求较大的DNA片段进行交换存在重组热点需要重组酶(RecA,RecBCD)126当前126页，总共161页。(2)转座重组（TranspositionRecombination）(replicationrecombination)不依赖转座子和靶序列间的同源性需要转座酶导致插入、缺失、倒位和重排…127当前127页，总共161页。(3)位点特异性重组（Site-SpecificRecombination）直接在专一序列之间配对而发生重组，即噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中必须有位点特异的蛋白质因子参与催化不需要重组酶128当前128页，总共161页。异常重组（Site-DependentSpecificRecombination）不需要DNA序列的同源性不需要重组酶和转座酶的参与目前对重组机制了解不清楚129当前129页，总共161页。（1）同源重组的基本特征涉及同源染色体的同源序列间的联会配对涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号（2）同源重组的分子模式1964．Holliday.R提出链转移模型，之后经Meselson和Radding修改

HollidayIntermediate7.5.3同源重组的分子机制130当前130页，总共161页。（3）同源重组的酶学机制A）RecA蛋白质在联会和链交换中的作用大肠杆菌中为单肽链，又称为重组酶(recombinase)功能：促进同源DNA联会和促进DNA分子间的单链交换具有单链DNA结合活性；具有双链DNA结合活性；具有NTP酶活性；促进互补单链复性的能力131当前131页，总共161页。B）RecBCD蛋白质在同源重组中的作用除RecA蛋白外，在大肠杆菌中还需要recB、recC、recD、recE、recF、recG、recJ、recK、recL和recN的产物目前，只有RecA，RecB，RecC，RecD已经分离纯化出来recB、recC、recD基因分别编码三条多肽链，三者构成一个在同源重组中的功能单位－－RecBCD蛋白质132当前132页，总共161页。RecBCD（核酸外切酶Ⅴ））Apoly-functionalenzyme具有依赖于ATP的单链和双链外切酶活性；具有依赖于ATP的螺旋酶活性；具有序列特异的单链内切酶活性；具有较低的再旋酶活性。133当前133页，总共161页。(4)同源重组的过程Hollidaystructureforming★切断(Nicking)★链置换(Stranddisplacement)★单链侵入(Single-strandinvasion)★噜噗切除(Loopcleavage)★链同化(Strandassimilation)★异构化(Isomerization)★分支迁移(Branchmigration)Hollidaystructureresolution线状DNA双螺旋的重组134当前134页，总共161页。5‘3‘5‘3‘切断nicking链置换Stranddisplacement单链侵入Single-strandinvasion噜噗切除Loopcleavage链同化Assimilation异构化Isomerization分支迁移Branchmigration由DNA内切酶在同源联会的两个DNA分子中任意一条链出现单链切口（RecBCD作用）切口处形成的5’端局部解链，由细胞内类似于大肠杆菌DNA聚合酶I的酶系统利用切口处的3’-OH合成新链，而把原有的链逐步排挤置换出来，使之成为游离的以5’-P为末端的单链区段由链置换产生的单链区侵入到参与联会的另一条DNA分子因局部解链而产生的单链泡中（RecA作用）侵入的单链DNA与参与联会的另一条DNA分子中的互补链形成碱基配对，同时把与侵入单链的同源链置换出来，从而产生D-噜噗，D-噜噗的单链区随后被切除降解掉。噜噗切除中产生的3’-OH断头和侵入单链的5’-P由DNA连接酶共价连接。同时侵入的单链可以沿5’-3’方向继续置换出噜噗切除中产生的5’-P断头，后者不断被5’-3’外切酶活性切除降解。链同化进行过程中，DNA经过一定的扭曲旋转而形成异构体。从而，两条DNA分子不再以一条链相连，而且以两条同源的单链交叉相连，相连的链不再是前面一系列变化中涉及的单链而是原来一直“安然未动”的链。该结构成为Holliday结构。两条DNA分子之间形成的交叉点可以沿DNA移动，这一过程称为分支迁移。迁移实际是两条DNA分子之间交叉的同源单链互相置换的结果135当前135页，总共161页。HollidayIntermediatestructure136当前136页，总共161页。Holliday中间体的拆分Holliday中间体的形成只完成了重组的一半，由它连锁在一起的两条DNA分子必须经过拆分回复到彼此分开的双螺旋分子状态拆分需要内切酶在交叉点形成一对切口，然后由DNA连接酶连接交联在一起的两条DNA分子实际上不断处在一种异构变化中，切口可能在两对同源链中的任意一对上发生137当前137页，总共161页。右半部绕轴1旋转180°12解堆集上半部绕轴2旋转180°AbaBABabABabABbabBAa重堆积138当前138页，总共161页。139当前139页，总共161页。ResolvingHollidayjunctionB转换，A、C重组B转换，A、C无重组140当前140页，总共161页。处于异源双链区两侧的基因在形成重组DNA分子的拆分中可以发生交互重组（重组型），也可以不发生交互重组（亲本型）处于异源双链区内的基因或遗传标记，不论拆分以何种方式发生都将影响到它们的遗传学行为许多子囊菌是研究异源双链区遗传学变化的好材料141当前141页，总共161页。子囊孢子的特点一个杂合体通过减数分裂而产生的四个核位于同一个大的细胞即子囊中，而且四个单倍体的核呈线性排列，然后发生一次有丝分裂，产生8个线型排列的子囊孢子在不发生重组时，具有两种不同颜色的孢子按4:4的比例出现但有时会出现5:3或6:2的分离142当前142页，总共161页。基因转换：在不发生基因重组的情况下，具有两种不同颜色的孢子按4：4的比例出现发生基因重组时，错配修复系统能够识别异源双链的不配对区，并以其中一条链为模板修复另一条链。子囊菌野生型g+（子囊孢子为黑色）和g-（子囊孢子为灰色）通过对异源双链区内不配对碱基的修复而进行的基因校正过程—基因转换143当前143页，总共161页。AAaa减数分裂后的DNA无重组有丝分裂AAAAaaaaAAaa无修复有丝分裂AAAaaAaa发生修复144当前144页，总共161页。有丝分裂AAaaaAaa只有一条链按粗线修复AaAa有丝分裂AAaaaaaa两条链按粗线修复AaAa145当前145页，总共161页。概念：在专一序列之间配对而发生重组，即噬菌体基因整合到细菌染色体基因组中去，因此，重组只需要有限的同源序列，但必须有位点专一性的蛋白因子参与催化。也称定位重组。特点：定位重组中DNA片段不是转移到基因组的另外地方，而是在重组酶作用下被切除或倒置。7.5.4位点专一性重组（site-specificrecombination）146当前146页，总共161页。位点专一性重组最早在噬菌体的遗传学研究中发现噬菌体的两种状态：裂解状态：DNA在宿主细菌中以环状分子独立存在溶源状态：噬菌体DNA则是细菌染色体的整合部分，称为原噬菌体整合和切除均通过细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组实现，特定位点叫做附着点（attachmentsite,att）147当前147页，总共161页。E.

coliDNA上的att位点叫做attB，含有B、O和B’三个序列噬菌体DNA上的att位点叫做attP，由P、O和P’三个序列构成B、B’、P、P’序列大不相同，而O序列完全一致，是位点特异性重组的地方，称为核心序列。O序列全长15bp，富含A-T碱基对，无IR序列整合反应需要整合酶（Integrase,Int）和整合寄主因子（integrationhostfactor,IHF）Int只能催化BOB’和POP’之间的重组，不能催化BOP’和POB’之间的重组，在只有整合酶存在时整合反应是不可逆的IHF是一种蛋白质，含有两个亚基，均由寄主基因编码，IHF也与att位点结合148当前148页，总共161页。切除反应发生