激光共聚焦技术

关于激光共聚焦技术第1页，共23页，2023年，2月20日，星期五Zeiss

LSM510META激光共聚焦显微镜的基本结构激光光源冷却系统扫描器光学装置荧光显微镜系统图象存储与处理及控制系统针孔光栏分光镜发射荧光单色器检测器第2页，共23页，2023年，2月20日，星期五激光扫描共聚焦显微镜（LSM）是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，观察细胞的形态变化或生理功能的改变。成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学和遗传学等领域中新的有力研究工具。第3页，共23页，2023年，2月20日，星期五激光共聚焦显微镜在生物学中的应用原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构检测核酸检测蛋白质细胞定位检测细胞凋亡细胞器的观察及测定检测细胞融合观察细胞骨架检测细胞间缝隙连接通讯检测细胞内脂肪活体细胞或组织功能的实时动态监测实时定量测定细胞内Ca2+变化测定细胞内pH变化检测膜电位变化检测细胞内活性氧物种的产生检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位检测荧光共振能量转移检测荧光漂白恢复第4页，共23页，2023年，2月20日，星期五荧光显微镜系统激光共聚焦显微镜所用的荧光显微镜大体与常规荧光显微镜相同，但又有其特点。需与扫描器连接。使激光能进入显微镜物镜照射样品，并使样品发射的荧光到达检测器。需有光路转换装置。即汞灯与激光转换，同时汞灯光线强度可调。荧光镜座要有防震动装置。第5页，共23页，2023年，2月20日，星期五激光共聚焦显微镜工作原理示意图激光经放大、分光后由物镜聚焦于焦平面上，同时，焦平面上被激光扫描的点F所发出的一定波长的荧光通过检测针孔光栏达到检测器，并成像于显示器上，得到相应的荧光图象。第6页，共23页，2023年，2月20日，星期五激光共聚焦显微镜基本操作获取共焦图像的步骤在VIS模式中观察样品

装入LSM配置

扫描图像

保存图像第7页，共23页，2023年，2月20日，星期五不同厚度光切图像第8页，共23页，2023年，2月20日，星期五

Z轴扫描时间系列扫描Z轴扫描＋时间系列扫描Z轴扫描、时间系列扫描第9页，共23页，2023年，2月20日，星期五组织和细胞样品中荧光的来源自发荧光荧光染色免疫荧光－荧光抗体法产生荧光外源性荧光物质进入组织细胞内产生荧光酶致荧光第10页，共23页，2023年，2月20日，星期五荧光样品的制备要求荧光标记反应的特异性强、荧光定位准确保持样品应有的结构形态完整性荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性荧光强度适宜荧光稳定性好样品的荧光分布均匀两种及两种以上的荧光信号之间荧光光谱交叉可以消除图象背景干净、干扰杂质少第11页，共23页，2023年，2月20日，星期五荧光探针的种类及应用原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构检测蛋白质、抗体及其他分子：荧光蛋白（GFP、YFP等）活体细胞或组织功能的实时动态监测实时定量测定细胞内Ca2+变化：fluo-3/AM，fura-2第12页，共23页，2023年，2月20日，星期五荧光探针标记样品的过程样品预处理给药、切片或细胞标本的制备荧光探针标记样品第13页，共23页，2023年，2月20日，星期五百合花粉管钙离子浓度梯度检测液体培养基中培养百合花粉观察花粉管生长情况，长度大概为花粉粒直径的2－5倍，过长的花粉管会弯曲扭转不利于观察。第14页，共23页，2023年，2月20日，星期五荧光探针Fluo-3（/AM）属于单波长染料，用于测定钙离子的相对浓度。Fluo-3/AM是fluo-3的一种乙酸甲酯衍生物，fluo3/AM是脂溶性物质，能跨膜进入细胞。在细胞浆中被水解脱掉AM后，变成游离的fluo-3，因其不具备跨过完整细胞膜的特性因此停留在细胞内。游离配体形式的fluo-3是非荧光性的，但是当它与Ca2＋结合后，形成具有荧光的fluo-3-Ca，是细胞荧光强度增加40至80倍，而且其荧光强度与细胞内[Ca2＋]呈正相关，因此可以得到Ca2＋浓度。另外Fluo3对于紫外光照射下可裂解的螯合钙或其它形式的钙也有作用。第15页，共23页，2023年，2月20日，星期五save

“projection”

Projection第16页，共23页，2023年，2月20日，星期五图7～10.

7.连续降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示冬小麦胞内荧光有相同的变化趋势。8.连续降温下生成Ca2+荧光随时间变化的曲线同时记录的荧光图像,显示春小麦胞内荧光有相同的变化趋势。9.Fluo-3/AM染色后,静息态下冬小麦原生质体的三维重组图像。10.Fluo-3/AM染色后,静息态下春小麦原生质体的三维重组图像。刘炜等，低温处理对冬、春小麦细胞Ca2+时空变化的影响，植物学报，2001，43(12):1218－1223第17页，共23页，2023年，2月20日，星期五第18页，共23页，2023年，2月20日，星期五目的蛋白细胞器定位观察含有荧光蛋白的载体pA7-GFP目的基因洋葱表皮第19页，共23页，2023年，2月20日，星期五XbaI,SmaI,BamHI目的蛋白细胞器定位观察含有荧光蛋白的载体pA7-GFPCaMV35SPromoterXhoI,NcoI,SalI,SpeIGFP目的基因第20页，共23页，2023年，2月20日，星期五目的蛋白细胞器定位观察对提取的质粒，用目的基因的引物进行PCR鉴定，出现了目的片段。根据pA7-GFPVector上提供的酶切位点，对重组质粒进行双酶切，酶切后进行电泳分析，也出现了目的片段，表明目的片段已经和质粒DNA重组。

图3-9pA7-TTG1重组质粒酶切鉴定及PCR鉴定酶切：重组质粒酶切产物；M：MarkerDL2000；PCR：重组质粒PCR产物第21页，共23页，2023年，2月20日，星期五目的蛋白细胞器定位观察含TTG1的瞬时表达载体转入洋葱表皮细胞将提取好的的含有目的基因的瞬时表达载体以及pA7-GFP载体约20μL分别加入1.5mL离心管中，分别加入500μL的蒸馏水，两管分别标号P1，P2。(2)分别取4片约1.5cm*1.5cm大小的洋葱表皮放入P1，P2。(3)将P1，P2管管盖打开，用封口膜将其封上，扎两到三个小孔。(4)将P1，P2管进行抽真空，抽到刚刚沸腾为止，一共抽三次。(5)取MS培养基并在其上铺上一层滤纸。(6)取出P1，P2管中的洋葱表皮，将其铺在MS培养基的滤纸上，加少量的水培养16小时。第22页，共23页，2023年，2月20日，星期五目的蛋白细胞器定位观察

BrightGFP Merged

TTG1在津田芜菁洋葱表皮细胞中的瞬时表达检测A-C：G