Westernblot实验步骤说明

Westernblot原理WesternBlot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。由于Westernblot检测技术具有简便，快捷等特点，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。WesternBlot信号放大基本原理经过SDS分离的蛋白质、多肽等被转移到固相支持膜上，然后用蛋白质或多肽特异性的抗体来检测一级信号放大二级信号放大一抗抗原抗原一抗二抗WesternBlot一般流程底片扫描、分析底物显色二抗孵育一抗孵育封闭转膜SDS电泳蛋白样品的制备WesternBlot基本实验步骤1、蛋白质提取：WIP或RIPA裂解细胞或研磨组织，离心，收集上清。2、蛋白定量：先总蛋白定量，western后在依据内参定量。3、电泳：依据需要检测蛋白的分子量选取胶的浓度，制胶，电泳。4、转膜：半干或湿转，应用半干法转膜需防止短路。5、封闭：5%脱脂奶粉或BSA封闭过夜或室温1小时。6、一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4度过夜，1xTBST洗膜3次，每次5分钟。7、二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时，1xTBST，洗膜3次，每次5分钟。8、显影(ECL法)：将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。9、图片分析：标定Marker，进行分析与扫描。贴壁细胞：细胞可以在培养皿里裂解，洗掉培养基，PBS洗2~3次，加入RIPA裂解液裂解，以可以将细胞消化下来，离心，PBS洗2~3次，加入RIPA冰上裂解液裂解30分钟（可提高蛋白浓度）。按6孔板100-200微升/孔的比例加入PIPA(可根据细胞多少调节裂解液体积）,4度，12000转，离心15分钟，收集上清.悬浮细胞:收集培养细胞，离心去除培养液，用PBS洗2-3遍，按6孔板加入100-200微升/孔的比例加入RIPA，用抢悬浮细胞。如果细胞数量较大，应按50-100万细胞/管分装或根据细胞数量按比例增加RIPA的用量，裂解完全时应无明显的细胞颗粒。4度，12000转，离心15分钟，收集上清.组织样品：液氮研磨组织，按每20毫克组织加100-200微升的比例加入RIPA,冰上裂解30分钟，4度，12000转，离心30分钟，收集上清.蛋白样品的制备蛋白样品的定量

Bradford法测定蛋白浓度原理：此法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在595nm处有最大光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。考马斯亮兰溶液的配制：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%(W/V)磷酸，将溶液用水稀释到1000mL，过滤。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G250，4.7%(W/V)乙醇，和8.5%(W/V)磷酸。实验步骤：96孔板，对照20μlPBS,测定蛋白样品:18μl+2μl蛋白，加入200μl考马斯亮兰溶液，放置2分钟（在一个小时内测，时间变长，可能会产生沉淀），酶标仪上595nm处测定吸光值，这样只能相对定量蛋白，如果要定量蛋白，可以用不同梯度的BSA做标准曲线来定量蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：

SDS是一种阴离子表面活性剂.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和SDS的平均结合量是1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS后,由于SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

电泳注意：（1）所有蛋白样品定量一致，体积以一致，不够的用裂解液补满，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积，这样可以避免最边上的孔道电泳时出现扩散，使最边上的孔道电泳出现误差。（2）WesternBlot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。（3）浓缩胶的目的使得loading的样品能够在同一条水平线上进入分离胶，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋白赶上来前进入分离胶。而在分离是理论上小电压长时间分离的效果会更好，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好，同时制胶前一定要使胶混匀，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。转膜PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差，背景相对叫弱。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好，但背景相对叫强。分类：半干法和湿法转移是两种不同的转移装置下的转移系统，将膜，胶，滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的，叫湿法；用滤纸吸buffer来做转移体系的叫半干法。BIO-RAD的半干转运系统的弱点就是无法控温，当电流过高，而系统的散热又比较差，滤纸的吸水性比较差的情况下，就很容易烧胶。转膜半干实验步骤：先将PVDF膜在甲醇中浸泡约30s,在放入转膜缓冲液里浸泡数分钟。每块胶用60mA，1h，从下到上的顺序：阴极/滤纸/PVDF膜/凝胶/滤纸,凝胶面向阴极，保持湿润和没有气泡。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。

湿转实验步骤：将膜，凝胶放置到湿转夹子中，膜面向正极，凝胶面向负极，100V稳压转膜1.5小时，时间和电压可以根据转移蛋白质分子量进行相应调整，转膜后丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带转移到膜上的效率。封闭原理：脱脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封闭膜，避免标记抗体固定在膜上引起背景增高，即脱脂奶粉中的蛋白通过疏水作用与膜上没有蛋白的部分结合，从而可以阻止一抗与膜通过疏水作用结合而产生很高的背景。种类：常用的封闭液有bovineserumalbumin(BSA),non-fatmilk,casein,gelatin,tween-20等,一般用non-fatmilk.实验步骤：

5%脱脂奶粉（用1xTBS配制，或1xTBST配制）封闭过夜或室温1~2小时。一抗、二抗孵育1：原理：一抗可以与要检测的蛋白特异结合，二抗可与一抗结合，同时二抗上带有特异的酶（如辣根过氧化物酶HRP，碱性磷酸酶法AP,化学发光显色法HRP),此酶可以分解底物使胶片感光。2：实验步骤：一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4度过夜（抗体浓度及孵育时间需根据不同的抗体做相应调整，1xTBST，洗膜3次，每次5分钟

二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时，