植物组织培养的基本技术

关于植物组织培养的基本技术第1页，共78页，2023年，2月20日，星期四第一节实验室结构、仪器设备及操作技术第二节培养基的组成、配制与灭菌第三节植物离体培养体系的建立

本章内容第2页，共78页，2023年，2月20日，星期四一、植物组织培养实验室的结构及设计要求：准备室;无菌操作室;培养室;温室；细胞学实验室第一节实验室结构、仪器设备及操作技术第3页，共78页，2023年，2月20日，星期四（一）准备室：

1.主要功能：用于培养器皿的清洗、培养基的配制、分装和灭菌、试管苗的出瓶及整理等工作。2.主要仪器设备及用品：

冰箱、天平、高压灭菌锅、pH计、干燥箱、实验台、水槽、凉干架、药品柜、离心机、水浴锅、微波炉、电炉、磁力搅拌器、蠕动泵、移液器、各种玻璃器皿（烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶、三角瓶等）及培养基分装用品等。第4页，共78页，2023年，2月20日，星期四百分之一天平千分之一天平万分之一天平第5页，共78页，2023年，2月20日，星期四各种型号的高压灭菌锅第6页，共78页，2023年，2月20日，星期四

移液器第7页，共78页，2023年，2月20日，星期四（二）接种室（无菌操作室）：

1、功能：植物材料的灭菌、接种以及培养物的继代转接等。接种室要求保持洁净，与化学实验室之间应设置缓冲室。2、仪器设备及用品：

超净工作台、紫外灯、小推车、搁架、磁盘、接种工具（各种镊子、解剖刀、手术剪、普通剪刀接种针、酒精灯、手持喷雾器、细菌过滤器等）等。第8页，共78页，2023年，2月20日，星期四超净工作台第9页，共78页，2023年，2月20日，星期四（三）培养室：

1、功能：主要用于植物材料的培养。要求室内洁净并能保持一定的温度、光照以及湿度以适合植物材料的生长和分化。2、仪器设备及用品：培养架及灯管、摇床（振荡器）、空调、自动定时器、加湿及除湿器、光照培养箱、温湿度计等。第10页，共78页，2023年，2月20日，星期四培养架第11页，共78页，2023年，2月20日，星期四光照培养箱第12页，共78页，2023年，2月20日，星期四恒温振荡器

多用振荡器第13页，共78页，2023年，2月20日，星期四（四）细胞学实验室：

1、功能：主要用于培养材料的显微观察及照相等。2、仪式设备及用品：

体视显微镜、普通显微镜、倒置显微镜、荧光显微镜、配套显微照相装置、普通相机或数码相机、切片机及配套制片及染色用品等。第14页，共78页，2023年，2月20日，星期四体视显微镜普通光学显微镜倒置显微镜倒置荧光显微镜第15页，共78页，2023年，2月20日，星期四二、实验室基本操作：（一）洗涤：

1、普通器皿：采用洗衣粉、洗洁精等中性洗涤剂洗涤。

2、难清洗器皿及移液管等：用水清洗后再用重铬酸钾洗液浸泡，最后清水冲洗，或用超声波仪清洗。第16页，共78页，2023年，2月20日，星期四（二）灭菌：

1、器具灭菌：培养皿、解剖刀、镊子等用品。（1）干热灭菌：铝箔包好后，放于恒温干燥箱内，150℃保温2小时，成本较高。（2）高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌锅内120℃15-20min

。（3）灼烧灭菌：接种时，解剖刀及镊子等浸入95％乙醇，然后取出在酒精灯火焰上灼烧杀菌。第17页，共78页，2023年，2月20日，星期四2、培养基灭菌：

采用高压蒸汽灭菌，120℃15－20min。培养基体积越大，灭菌时间越长。3、不耐高温化合物：

采用过滤灭菌，如IAA等。4、外植体的表面灭菌：

采用70－75％乙醇（10-30秒）、有效氯1％的次氯酸钠（5-30分钟）、0.1－0.2%的氯化汞（2-15分钟）等。杀菌剂中加入几滴吐温－20或80（Tween－20或80）效果较好。第18页，共78页，2023年，2月20日，星期四（三）无菌操作：

1、保持接种室的无污染环境，定期熏蒸或喷雾处理，进行消毒。接种前打开超净工作台及紫外灯照射20-30min，关闭紫外等灯后使气体散出后开始操作。

2、保持超净工作台的洁净：接种前用70％乙醇擦拭台面或用喷壶喷雾，操作前，将手和手臂用70％乙醇消毒，所需试验用品用乙醇擦拭后放入超净工作台。第19页，共78页，2023年，2月20日，星期四3、点燃酒精灯，进行操作，接种材料前后，灼烧瓶口，工具要灼烧彻底，防止交叉污染。4、保持接种室的洁净，发现污染及时挑出，并在灭菌后清洗，以减少污染源。5、操作中穿工作服、戴口罩、工作帽，出入接种室换拖鞋以保持接种室的洁净。第20页，共78页，2023年，2月20日，星期四

第二节培养基的组成、配制与灭菌第21页，共78页，2023年，2月20日，星期四一、培养基的组成和作用培养基（medium）是植物组织培养的重要材料，是外植体生长的营养物质，只有配制出适宜的培养基，才能使组织培养获得成功。通常植物组织培养所用培养基包括以下六大类成分，即矿质营养、有机成分、植物生长调节剂、碳源、琼脂以及其他附加物等。培养基的主要指标是营养成分及植物生长调节物质的浓度。第22页，共78页，2023年，2月20日，星期四

培养基成分

水

植物激素

碳源

有机物（维生素、肌醇、氨基酸）

培养体支持材料

辅助性物质

无机盐（大量元素、微量元素、铁盐）第23页，共78页，2023年，2月20日，星期四

碳源碳源主要为细胞提供合成新化合物的骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，此外还能维持一定的渗透压。常用的碳源主要是蔗糖，使用浓度在10-50g/L，此外果糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、甘露糖及可溶性淀粉等也常用于植物组织培养。但在胚培养时采用40-150g/L的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用糖浓度高低直接影响形态建成。第24页，共78页，2023年，2月20日，星期四无机盐元素名称添加形式

NKNO3,NH4NO3大量PKH2PO4NaH2PO4元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2·2H2OMgMg2SO4·7H2OSMg2SO4·

7H2OFeFeNa2-EDTA微量BH3BO3元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2·2H2O第25页，共78页，2023年，2月20日，星期四种类：VB1（盐酸硫胺素）、VB6（盐酸吡哆醇）、Vpp（烟酸）、Vc(抗坏血酸）浓度：0.1-1.0mg/L

作用：VB1促愈伤组织产生，提高活力

VB6促根生长

Vpp与代谢和胚发育有关

Vc防组织褐变维生素第26页，共78页，2023年，2月20日，星期四肌醇(又叫环己六醇）

能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。使用浓度一般为50～lOOmg／L第27页，共78页，2023年，2月20日，星期四氨基酸(alminoacide)

培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用，用量在1-3mg／L之间。有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，用量在10～1000mg／L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。第28页，共78页，2023年，2月20日，星期四1、生长素类(auxin)（1）IAA(吲哚乙酸)是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。（2）NAA(萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3～4倍，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。（3）IBA(吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。（4）2,4-D(2,4-2氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。植物激素第29页，共78页，2023年，2月20日，星期四2、细胞分裂素类(cytokinin)（1）6-BA(6-苄基氨基嘌呤）应用广，人工合成。（2）Zt(zeatin玉米素)是一种活性最大的天然细胞分裂素，效果显著，但非常昂贵。（3）Kt(糠基腺嘌呤）功能：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化第30页，共78页，2023年，2月20日，星期四

3、GA(gibberellicacid赤霉素)

培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。第31页，共78页，2023年，2月20日，星期四

高有利于根的形成和愈伤组织

生长素/细胞分裂素

适中有利于根芽的分化

低有利于芽的形成

生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。一般生长素浓度的使用为0.05～5mg／L，细胞分裂素0.05～10mg／L。第32页，共78页，2023年，2月20日，星期四培养体支持材料1.琼脂A用量7－10g/LB新买应试凝固力2.其它玻璃纤维滤纸桥海绵等▲第33页，共78页，2023年，2月20日，星期四辅助性物质抗生素抗氧化物活性炭天然复合物▲第34页，共78页，2023年，2月20日，星期四1.常用种类：青霉素链霉素庆大霉素等2.用量：5－20%3.注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重

抗生素第35页，共78页，2023年，2月20日，星期四抗氧化物常用抗氧化剂及使用：半胱氨酸、VC（50－200mg/L液洗涤外植体伤口表面）。

活性炭1.作用：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1-0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）。利于胚胎培养。2.常用浓度：0.5-10g/L

3.注意：活性炭具副作用。▲第36页，共78页，2023年，2月20日，星期四椰乳：一般使用浓度在100～200ml／L它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用。香蕉：用量为100～200ml／L。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。马铃薯(potato)：去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150～200g／L，对pH值缓冲作用也大，添加后可得到健壮的植株。水解酪蛋白：为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100～200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。天然复合物第37页，共78页，2023年，2月20日，星期四

培养基种类MS培养基B5培养基White培养基N6培养基KM-8P培养基

基本培养基二、培养基的类型：第38页，共78页，2023年，2月20日，星期四N6培养基特点：成分简单KNO3

和(NH4)2SO4含量高适合花药培养★White培养基特点：无机盐量较低，适合生根培养第39页，共78页，2023年，2月20日，星期四B5培养基特点：含较低的铵双子叶植物尤其木本植物组培可选择MS培养基特点：无机盐、离子浓度高，硝酸盐含量较高。有机成分复杂用于原生质体培养(包括原生质融合的培养)KM-8P培养基特点：第40页，共78页，2023年，2月20日，星期四表1

MS培养基的组成配方组成成分数量(mg/L)组成成分数量(mg/L)NH4NO31650Na2-EDTA37.3KNO31900FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O440CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O370蔗糖30KH2PO4170pH5.8KI0.83肌醇100.0H3BO36.2烟酸0.5MnSO4·4H2O22.3盐酸吡哆醇0.5ZnSO4·7H2O8.6甘氨酸2.0Na2MoO4·2H2O0.25盐酸硫铵等0.4CoCl2·6H2O0.025第41页，共78页，2023年，2月20日，星期四表2

B5培养基的组成和配方组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l)KNO32500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4

134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO4

3.0烟酸1.0MnSO4·4H2O10盐酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激动素0.1Na2MoO4·2H20.252,4－D0.1－1.00.025盐酸硫铵10Na2-EDTA37.3

CoCl2·6H2O第42页，共78页，2023年，2月20日，星期四表3N6培养基的组成和配方组成成分数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇0.5H3BO3

1.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4盐酸硫铵1.0ZnSO4·7H2O1.5第43页，共78页，2023年，2月20日，星期四三、培养基母液及激素母液的配制：母液：欲配制液的浓缩液。一般母液配成比所需浓度高10～100倍。大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类母液等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。母液配好后放入冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。第44页，共78页，2023年，2月20日，星期四（一）母液配制流程图

称量

母液分装确定培养基

溶解

定容

贴标签保存于冰箱母液配制(以MS为例)第45页，共78页，2023年，2月20日，星期四母液种类种类成分规定用量(mg/L)扩大倍数称取量(mg)母液定容体积(ml)配1LMS培养基吸取量(ml)

大量元素

KNO3NH4NO3MgSO4.7H2OKH2PO4CaCI.2H2O19001650370170440

203800033000740034008800

1000

50微量元素MnSO4.4H2OZnSO47H2OH3BO3KINa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCI2.6H2O22.38.66.20.830.250.0250.025

100223086062083252.52.5

1000

10铁盐Na2-EDTAFeSO4.7H2O37.327.810037302780100010有机物烟酸甘氨酸VB6VB1肌醇

50251005255000

500

100.520.50.1100第46页，共78页，2023年，2月20日，星期四(二)母液配制要求：1、母液浓缩倍数：10-100，大量元素20；微量元素100、铁盐100；有机物50；2、选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂3、防止沉淀:

Ca2+和S042-，Ca2+Mg2+和PO43-4、激素母液浓度：1mg/ml,1次配成50或100ml5、激素溶解：

IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于热水或95%酒精再加水；

2，4-D先溶于1mlNaOH再加水；

KT、BA先溶于1mlHCl再加水。

第47页，共78页，2023年，2月20日，星期四四、培养基的配制：1、量取母液：营养元素和激素。2、称量蔗糖、琼脂，放入600ml左右蒸馏水的锅内，电路上加热，使琼脂溶化。3、加入母液，混合均匀，调整pH值。4、分装入瓶，每瓶40－50ml。5、封口：用4－6层称量纸封口，之后灭菌备用。第48页，共78页，2023年，2月20日，星期四母液1100ml琼脂7g母液210ml蔗糖30g

母液310ml

母液410mlBA2mgNAA1.5mg加热定容1000ml用氧化钠调PH5.8分装（占容器1/4～1/3，不沾瓶壁口）高压灭菌（121°C，1.1kg/cm2，20min）第49页，共78页，2023年，2月20日，星期四

大量元素母液

微量元素母液

铁盐母液

有机物母液

取100ml取10ml取10ml取10ml注：MS培养基配制容量瓶要求：一次性移取，不能吸进吸耳球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。移母液第50页，共78页，2023年，2月20日，星期四用0.1MNaOH或HCl调PH值为5.8。趁热分装，100ml的三角瓶约装入30－40ml,35瓶/L。调PH值：分装：趁热分装，100ml的三角瓶约装入30－40ml,35瓶/L。第51页，共78页，2023年，2月20日，星期四扎口与灭菌:要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。培养基应及时灭菌，防止变质。第52页，共78页，2023年，2月20日，星期四五、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）：1、加热：灭菌前检查灭菌锅内水量是否充足，然后将培养基放于灭菌锅内，改好盖，关闭放气阀，打开电源，加热升温。2、排气：当温度升至0.05MPa时，打开放气阀彻底排出锅内冷空气。然后关闭放气阀，促使压力继续上升。第53页，共78页，2023年，2月20日，星期四3、温度控制：

当锅内压力升至0.10MPa时，计时15－20分钟，计时结束后，关闭电源。4、出锅：

当灭菌锅自然冷却后，取出培养基，放置于接种室备用。第54页，共78页，2023年，2月20日，星期四六、培养基的保存：1、防尘：防治灰尘污染。2、避光：吲哚乙酸等易于分解，要注意遮光。3、恒温：4oC可保存3－6周，室温下两周内用完。4、定期更新：不易长期保存。第55页，共78页，2023年，2月20日，星期四第三节植物离体培养体系的建立第56页，共78页，2023年，2月20日，星期四一、植物组织培养的阶段划分：通常将组织培养过程划分为四个阶段

1、起始培养阶段（诱导阶段）

2、增殖培养阶段

3、生根培养阶段

4、驯化移栽第57页，共78页，2023年，2月20日，星期四第58页，共78页，2023年，2月20日，星期四（一）外植体的起始培养过程

1、起始培养的一般过程：

A、选取适宜的基因型（品种）；

B、选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎段、节间、叶片、叶柄等。

C、流水冲洗外植体；

D、外植体切割、分离及灭菌处理；

E、外植体接种于诱导培养基。

F、环境条件控制促进外植体的生长。二、外植体起始培养（无菌体系建立）第59页，共78页，2023年，2月20日，星期四2、接种外植体的生长过程：

A细胞分裂的启动；

B细胞增殖；

C组织和器官的形成。

第60页，共78页，2023年，2月20日，星期四第61页，共78页，2023年，2月20日，星期四（二）影响外植体起始培养的因素：

1、影响外植体起始的因素

A

外植体

B

培养基组成成分

C培养条件第62页，共78页，2023年，2月20日，星期四外植体：

(1)外植体种类及基因型

(2)外植体供体植株和外植体的来源与生理状态

(3)外植体大小

(4)外植体的极性第63页，共78页，2023年，2月20日，星期四外植体种类及基因型单子叶植物不易诱导器官发生。b.木本植物较难诱导。c.存在基因型差异（如番茄29%~63%）d.开始生长季节取材容易诱导。第64页，共78页，2023年，2月20日，星期四外植体状态：第65页，共78页，2023年，2月20日，星期四外植体大小：外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体增殖较快。外植体极性：当外植体以形态学的基部接种于培养基上时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。第66页，共78页，2023年，2月20日，星期四B、培养基