传染性法氏囊病毒的分离与测序鉴定,病毒学论文

传染性法氏囊病毒的分离与测序鉴定,病毒学论文内容摘要：传染性法氏囊病〔Infectiousbursaldisease,IBD〕是由传染性法氏囊病病毒〔Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV〕引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。本实验从山西省不同地区疑似法氏囊病鸡中分离到法氏囊病毒，经鸡胚培养繁衍、电镜观察、提取RNA、设计引物、cDNA的PCR扩增、电泳、测序。通过序列分析比对，最后鉴定其为传染性法氏囊病毒株。

本文关键词语：法氏囊病毒；分子鉴定；VP2基因；

鸡传染性法氏囊病〔IBD〕于1957年初次在美国东海岸特拉华州南部冈博罗城的肉鸡群中发现，因而也称冈博罗病，Wintorfield于1962年从患病的小鸡鸡胚中分离出病毒，1972年定名为鸡传染性法氏囊病。80年代以后至90年代以来欧洲国家出现了致死率很高的超强毒传染性法氏囊病病毒株〔veryvirulentIBDV,vvIBDV〕.vvIBDV的流行特点以及病原特性：对鸡具有很强的致病性，鸡对IBD最易感阶段为3~6周龄，vvIBDV不仅能感染有较高母源抗体的3周龄以内的雏鸡，而且也能引起大周龄鸡发病；死亡率高；引起严重的法氏囊损伤是vvIBDV的又一显着特点：病死鸡的法氏囊显着肿大，严重出血，有的外观呈紫葡萄样。几十年来，已普遍达到几乎所有养鸡国家，给各国养鸡业带来宏大经济损失。[1]传染性法氏囊病超强毒〔IBDV〕引起鸡的免疫抑制，导致新城疫、马立克氏、禽流感、传染性支气管炎和球虫等病免疫失败。近年来，山西省及全国一些地方由于超强毒株的流行，导致常用的传统IBD弱毒疫苗和灭活疫苗不能提供足够的保卫，而造成免疫失败，也使本病的流行出现了新的特点，进而愈加重了对养禽业的危害。超强毒株能够冲破高水平母源抗体，毁坏常规疫苗的保卫作用，不仅能造成体液免疫抑制，而且对细胞免疫也有一定影响。本实验从山西省不同地区采集疑似法氏囊病鸡病料，主要采集的法氏囊特征是肿大、外表充血、出血，呈紫葡萄样切开可见黏膜弥漫性出血，并有黏稠的奶酪样物质覆盖。经病料采集处理、病毒纯化繁衍、电镜观察、提取RNA、设计引物、cDNA的PCR扩增、电泳、测序。通过序列分析比对，最后鉴定其为传染性法氏囊病毒株。

1材料

1.1鸡胚及雏鸡

SPF蛋购自山东省家禽研究所，由本实验室孵化室孵化至所需日龄鸡胚。试验鸡购自山西某鸡场；

1.2病料采集处理及病毒纯化繁衍

1.2.1病料的采集处理

从山西省不同地区疑似法氏囊病鸡中采集法氏囊病料，用PBS缓冲液无菌研磨，反复离心3次，取上清液。保存备用。

1.2.2病毒纯化

繁衍SPF鸡蛋60枚，分三批入孵，每批20枚。用常规的绒毛尿囊膜接种法，接种法氏囊病毒乳液，盲传几次，收获绒毛尿囊膜和尿囊液备用。

1.3试剂及诊断液

主要试剂：DNAmarker2000为TIANGEN公司产品；AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒为美国AXYGEN公司产品；PlasmidMinikitI〔100〕为OMEGABIO-TEK公司产品；碱法质粒提取溶液SolutionI、SolutionII、SolutionIII参照分子克隆实验指南配制；IBDV阳性血清和抗原购自中国哈尔滨兽医研究所。

1.4菌株及载体

大肠杆菌DH5由本实验室保存；PfastBacHTA表示出载体及相关产品购自Invitrogen;PMD18-T载体为宝生物工程〔大连〕有限公司产品；限制性内切酶EcoRI、XhoI购自NEB.

2方式方法

2.1病料采集处理及病毒纯化繁衍

2.1.1病料的采集处理

从山西省不同地区疑似法氏囊病鸡中采集法氏囊病料。主要选择法氏囊外观水肿呈胶冻样、出血呈紫葡萄状。将病料反复冻融三次，充分释放病毒粒子，增加病毒粒子含量，1:5生理盐水无菌研磨，再等体积参加4,000IU/mL青霉素和2,000IU/mL链霉素的双抗，放入-20℃保存，备用。用琼脂扩散试验检测病毒效价，被检病毒与标准法氏囊阳性血清出现明显的沉淀线。

2.1.2病毒纯化

繁衍取60枚SPF鸡蛋，分三批入孵，每批20枚。将第一批20枚鸡胚放入温箱中，每日翻蛋2~3次，注意保持湿度。4日后入孵第二批蛋，再4日后入孵第三批蛋。当第一批鸡胚10日龄时，法氏囊病毒乳液加等体积双抗30min;用常规的绒毛尿囊膜接种法，接种法氏囊病毒乳液；然后用熔化石蜡封口，放入温箱继续孵育，逐日观察。24h内无死亡的弃掉，48h以后死亡的鸡胚放入4℃保存，120h收集死活胚放入4℃。收获鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，将绒毛尿囊膜加PBS缓冲液无菌研磨，研磨后4℃放置1h,加等体积氯仿充分混匀至乳悬液，摇床过夜，反复冻融3次后，进行第二次接毒。同上述经过进行第三次接毒。第三次接毒收获的绒毛尿囊膜研磨后，用琼脂扩散试验检测病毒效价，被检病毒与标准法氏囊阳性血清出现明显的沉淀线。

2.2引物的设计与合成

根据genbank登录IBDVVP2基因参考序列和表示出载质粒pFastBacHTA表示出阅读框设计VP2基因扩增引物：P1:5-CGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACC-3；P2:5-CCCTCGAGCACCGGCACAGCTATCCTCCTTAT-3；两头分别引入EcoRI和XhoI酶切位点。引物由生工生物工程〔上海〕股份有限公司合成。

2.3病毒RNA的提取

用Trizol法提取RNA,详细步骤为：取250?L病毒液于一普通的1.5mLEP管中，参加750uLTrizol,震荡混匀，静置5min.参加150?L氯仿，震荡混匀，4℃离心，12,000r/min,5min.取上清参加450?L异丙醇，颠倒混匀，4℃离心，12,000r/min,12min.弃液体，加1mL75%DEPC乙醇洗涤，4℃离心，12,000r/min,5min.弃液体，虹吸，枯燥沉淀。加9?LDEPC水，50℃水浴10min,开场反转录。

反转录步骤为：10?LRNA、1?L随机引物和4?LdNTP混匀，65℃水浴8min后迅速冰浴5min.再参加4?LBuffer、1?L反转录酶和1?LRNaseinhibitor,37℃水浴2~3h.以反转录产物为模板，P1和P2为引物进行PCR反响。

PCR反响体系：5StarBuffer5?L,dNTP2?L,4?L模板，P1和P2各0.5?L,Primestar0.25?L,ddH2O12.75?L.PCR反响条件：98℃预变性10s;98℃变性10s,55℃退火15s,72℃延伸100s,共30个循环，72℃终延伸10min.[1]凝胶电泳以鉴定分子量大小。将PCR产物根据AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒讲明书进行回收。取4.5?L回收产物参加5?LSollutionI和0.5?LVenter,混匀，4℃过夜。将连接产物转化入E.coliDH5感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5%的琼脂平皿上〔含氨苄青霉素100mg/L〕,37℃培养14h.挑单菌落接种入LB〔含氨苄青霉素100mg/L〕,振摇培养12h.按PlasmidMinikitI〔100〕讲明书提取质粒。质粒用EcoRI和XhoI双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为T-VP2.送上海生工测序。

2.4分离株VP2序列分析及推导氨基酸序列分析

测序结果表示清楚，分离株VP2基因核苷酸长度为1389bp,推导氨基酸序列含有347个氨基酸，采用DNAstar软件对测序结果进行分析，对照IBDV经典强、弱毒株及超强毒株高变区氨基酸序列分析分离株VP2分子特征。

2.5数据分析

分离株VP2高变区遗传进化树分析应用生物软件DNASTAR,对分离株和其他40株登录在GenBank中的参考毒株的VP2基因高变区〔43