SAMP8小鼠穹窿下器中部分核苷、蛋白质分布情况观察,细胞生物学论文

SAMP8小鼠穹窿下器中部分核苷、蛋白质分布情况观察,细胞生物学论文神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)是分布于神经系统内的具有自我复制、增殖能力和多向分化潜能的细胞群,能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等,是替代损伤神经细胞的潜在内生性资源。近年来,Bennett等在室周器官(circum-ventriculerorgans,CVOs)发现了神经干细胞,穹窿下器(Subfornicalorgan,SFO)作为一个较大的室周器官,缺乏血脑屏障,很多大分子都能够通过,是脑神经再生和修复的重要位点之一。本研究利用免疫组化及免疫荧光双标法,分别对SAMP8小鼠穹窿下器中溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,Br-dU)、性别决定基因高迁移率组蛋白(sexdeterminingregionY),SOX2以及巢蛋白(Nestin)阳性细胞分布进行观察。材料和方式方法1、材料SMP8小鼠20只,8月龄,体重18~22g,雌雄不限,均为二级实验动物,由天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供(清洁级,合格证号:W-J津实动质M准字第006号)。2、方式方法2.1分组随机分为四组,每组5只。一组按每只50㎎/㎏溶于0.3ml生理盐水的剂量,腹腔注射Br-dU(美国SIGMA公司),连续五天给药,天天两次,间隔8h,第六天进行BrdU免疫组织化学染色。另外三组,分别用于SOX2、Nestin免疫组化染色及Nestin/SOX2免疫荧光双标染色。2.2实验流程2.2.1麻醉动物开胸经主动脉灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.2),灌注完毕,取出整脑放入4%多聚甲醛后固定过夜。用于免疫组化的标本,梯度酒精脱水、浸蜡、包埋,Leika切片机连续切片,切片厚度5m,并于显微镜下确定位置,分别用于BrdU、Nestin和SOX2免疫组化染色;用于免疫荧光双标的标本,依次15%、30%蔗糖溶液组织脱水,Leika切片机连续冰冻切片,切片厚度10m,显微镜下确定位置,然后进行SOX2/Nestin免疫荧光双标染色。2.2.2免疫组织化学染色(1)BrdU免疫组织化学染色:石蜡切片常规脱蜡至水,50%甲酰胺抗原修复液中微波修复20min,冷却后,2SSC冲洗3min2次,0.3%Trition室温下15min,2mol/L的盐酸中室温下30min,0.1mol/L的硼酸缓冲液5min,0.05%胰蛋白酶37℃下消化20min。10%H2O2封闭内源性过氧化物酶10min,10%山羊血清37℃下封闭30min。参加一抗,小鼠抗BrdU单克隆抗体(美国SIGMA公司)(1∶100稀释),4℃冰箱孵育过夜。生物素标记山羊抗小鼠IgG,37℃温箱湿盒内孵育30min,辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃温箱湿盒内孵育30min。DAB显色,苏木精溶液复染,常规酒精脱水、透明、封片,OlympusBX-UCB显微照相系统观察摄片。以上步骤除血清封闭后直接一抗外,其余各步间用0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4)冲洗5min3次。DAB显色,苏木精溶液复染,常规酒精脱水、透明、封片,OlympusBX-UCB显微照相系统观察摄片。同时设阴性对照:一抗加0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4),其他步骤同前;且以侧脑室室下区作为阳性对照;(2)Nestin免疫组织化学染色:石蜡切片常规脱蜡至水,柠檬酸缓冲液中微波修复20min,冷却后,10%H2O2封闭内源性过氧化物酶10min,10%山羊血清封闭37℃下封闭30min。参加一抗,单克隆小鼠抗Nestin抗体(美国SIGMA公司)(1∶50稀释),剩余操作方式方法同BrdU免疫组化染色;(3)SOX2免疫组织化学染色:除一抗为多克隆山羊抗SOX2抗体(美国SIGMA公司)(1∶700稀释)外,其他操作方式方法同Nestin免疫组化染色。2.2.3免疫荧光双标染色冰冻切片依次浸入0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4)10min、0.3%TritonX-100中15min,然后10%山羊血清37℃下封闭30min。参加一抗,鼠抗Nestin单克隆抗体(1∶50稀释)及山羊抗SOX2多克隆抗体(1∶500稀释),4℃冰箱孵育过夜。避光参加二抗:FITC标记鸡抗小鼠IgG荧光抗体(1∶50)稀释,罗丹明兔抗山羊荧光抗体(1∶500稀释),37℃温箱湿盒内孵育2h,室温孵育30min。以上步骤除血清封闭后直接一抗外,其余各步间用0.01mol/LPBS(pH7.2~7.4)冲洗5min3次,参加荧光二抗后要避光冲洗。50%甘油封固,OlympusBX-UCB显微照相系统观察摄片。2.3阳性细胞计数BrdU阳性表示出细胞的细胞核呈棕褐色,阴性细胞细胞核为蓝色。SOX2阳性细胞的细胞核呈棕褐色,阴性细胞细胞核为蓝色。Nestin阳性细胞的细胞浆为棕褐色,阴性细胞的胞浆无染色。结果1BrdU、SOX2及Nestin阳性细胞在穹窿下器的分布1.1BrdU组织化学染色在SMP8小鼠穹窿下器连续切片上,BrdU阳性标记细胞的胞核呈棕褐色或棕黑色,着色不均匀,深浅不一。阳性标记细胞有的散在分布,有的成对分布,细胞核较小,有的呈椭圆形,有的形状不规则(Fig.1A)。1.2SOX2组织化学染色SOX2阳性细胞的胞核染色深浅不一,呈棕色或棕褐色,在室管膜区和大血管周围分布密集,其他部位散在分布。高倍镜下可见阳性细胞胞核多呈圆形或椭圆形,细胞核长2.5~5.5m,宽1.8~4.0m(Fig.1B)。1.3Nestin组织化学染色Nestin阳性表示出细胞的胞浆为棕色或棕褐色,大小不一,有多个数目不等的分支,细长的突起互相交织,呈絮状或丝状,在室管膜下区分布密集,背侧区分布较少,在两侧大血管周围呈放射状分布。高倍镜下可见到粗大的阳性颗粒,放射丝长11~45m,宽0.6~1.5m(Fig.1C)。2SOX2、Nestin阳性标记细胞在穹窿下器的分布SOX2阳性细胞胞核为红色,在室管膜区密集表示出,其他部位散在分布,胞核大小不一,形状不等,在室管膜区排列整洁,胞核长1~5m,宽1~3.5m(Fig.2A)。Nestin阳性表示出细胞为绿色,呈丝絮状或云片状分布,相互交织,丝状构造长15~35m,在室管膜下区和区分布密集,联合成片状(Fig.2B)。穹窿下器内可见散在的SOX2/Nestin双阳性细胞(Fig.2C)。讨论阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD),是伴随有进行性的认知功能障碍和记忆能力损害的一种老年人常见的中枢神经系统退行性疾病,其重要的病理改变之一就是大量神经元的死亡,因而以神经生发为基础的诊疗方式方法诊治AD已成为研究的热门。快速老化痴呆模型小鼠SAMP8是当前公认的理想的自然衰老痴呆模型,广泛应用于AD的研究。本研究通过对SAMP8小鼠穹窿下器中神经干细胞阳性标记物的表示出和分布进行观察,来进一步了解早期AD患者脑内神经干细胞/祖细胞的分布规律。神经干细胞是Reynolds等从成年小鼠纹状体分离出的能在体外不断分裂增殖并具有多种分化潜能的细胞群,当前有研究发现,哺乳动物的嗅球、海马、侧脑室的脑室区、室下区等均发现有神经干细胞存在,在适宜的条件下,神经干细胞能够自我增殖和多向分化,为研究及治疗中枢神经系统疾病提供了新的途径。神经干细胞/祖细胞的检测特异性标记物常用的有BrdU、SOX2及Nestin等。BrdU是一种胸腺嘧啶核苷的衍生物,在细胞有丝分裂的S期,能代替胸腺嘧啶掺入到细胞合成的DNA中,成为一种细胞增殖的标志。本研究通过给SAMP8小鼠连续5d腹腔注射BrdU,在SFO内发现有BrdU阳性细胞,这些细胞成对或散在分布,这讲明SAMP8小鼠穹窿下器存在有能够增殖的细胞,可能就是具有增殖、分化功能的神经干细胞/祖细胞。SOX2是一种转录因子,表示出于细胞核,能促进神经干细胞的转录,介入神经干细胞的维持。SFO内SOX2阳性表示出进一步提示了SFO可能存在有神经干细胞/祖细胞。LoriBennett等在成年大鼠侧脑室室下区、终板血管器、海马齿状回、最后区等部位发现了SOX2的阳性细胞,我室李力等在成年大鼠的室周器官之一最后区也发现了Nestin及SOX2阳性细胞,这支持了我们的推断与发现。同时,SOX2阳性细胞在室管膜区和大血管周围分布密集,讲明该处的细胞处于活泼踊跃期,因SOX2在很多正常组织细胞中都能够阳性表示出,SOX2阳性的细胞尚不能明确为神经干细胞/祖细胞。我们进一步研究发现,在SAMP8小鼠穹窿下器内Nestin也有明显阳性表示出。Nestin属于Ⅵ型中间丝纤维蛋白,是主要细胞骨架蛋白,存在于神经上皮的干细胞,在神经细胞构成期开场高表示出,在神经细胞迁移和分化后逐步消失,是应用最早也是应用最广泛的神经干细胞标志物之一。SAMP8小鼠穹窿下器Nestin阳性表示出进一步讲明该室周器官可能存在神经干细胞/祖细胞。Nestin阳性细胞在室管膜下区分布密集,讲明该区的神经生发功能可能比周围组织旺盛,与我们SOX2免疫组化研究结果一致。同时我们的结果表示清楚,Nestin的表示出低于SOX2的表示出,提示部分SOX2阳性细胞可能不是神经干细胞/祖细胞。免疫荧光双标染色中穹窿下器内存在SOX2/Nestin双阳性表示出细胞,进一步提示SAMP8小鼠穹窿下器存在神经干细胞/祖细胞的可能性。SFO是一体积较大的室周器