TCACM 1326.8-2019 化州柚种子超低温保存技术规程

ICS11.120.01C23团 体 标 准T/CACM1326.8—2019化州柚种子超低温保存技术规程TechnicalcodeofpracticeforcryopreservationofCitrusmaxima(Burm.)Merr.cv.Tomentosayseeds2019-10-17布 2019-10-17中 华 中 医 药 学 会 发布T/CACM1326.8—2019T/CACM1326.8—2019II目 次前言 II112范引文件 13语定义 14子收选择 24.1子收 4.2子择 5子处理 25.1活力 25.2水范围 6子存量 27子冻式 28复养 28.1子冻理 8.2后子活测 8.3芽苗 附录A（范附）剂的置保方法 4参考献 5T/CACM1326.8—2019T/CACM1326.8—2019鏈鏈鏈鏈前 言本标准是药用植物顽拗性种子超低温保存系列标准之一，该系列标准结构和名称如下：——T/CACM1326.1药用植物顽拗性种子超低温保存技术通则；——T/CACM1326.2白木香种子超低温保存技术规程；——T/CACM1326.3——T/CACM1326.4——T/CACM1326.5——T/CACM1326.6——T/CACM1326.7——T/CACM1326.8——T/CACM1326.9樟种子超低温保存技术规程；——T/CACM1326.10两面针种子超低温保存技术规程；………………。本标准按照GB/T1.1-2009《标准化工作导则第本标准由中华中医药学会归口。化州柚种子超低温保存技术规程范围Citrusmaxima(Burm.)Merrcv.‘Tomentosay本标准适用于化州柚种子的超低温长期贮藏。GB/T3543.6GB/T3543.7下列术语和定义适用于本文件。3.1化州柚 Citrusmaxima(Burm.)Merr.cv.‘Tomentosay’（Citrus（2015。3.2化州柚果实Citrusmaxima(Burm.)Merr.cv.‘Tomentosay’fruits10cm～15，宽11cm～13cm；803.3Citrusmaxima(Burm.)Merrcv.‘Tomentosa’seeds13.4种子低保存 seedofcryopreservation将经过前处理的化州柚种子置于液氮（-196℃）中保存。10月～11月果实成熟，采收成熟果实，剥开瓢囊，去除果皮和果肉，取出种子。挑选发育饱满、均匀、健康的种子为保存材料，置于4℃冰箱中保存备用（存放时间不超过1周）。活力化州柚种子活力以种子生活力为判别标准。按照GB/T3543.7中的2、3、5-三苯基氯化四氮唑(TTC)法检测种子生活力。随机抽取30粒种子，剥去外层种皮，沿种脊小心将种子分成2瓣后放培养皿内，内侧面向下，滴入TTC溶液浸没种子，室温(25℃)避光放置4h后，观察染色结果。TTC溶液的配制和保存方法见附录A的A.1和A.2。在光下用放大镜对染色结果进行观察鉴定。凡种胚周围出现黄色晕圈的种子为有活力的种子，否则为无活力的种子。待保存的化州柚种子生活力应≥60％。生活力按照公式（1）进行计算：式中：A——生活力；y——有活力的种子数；x——总的种子数。30h～120h3％～102按照GB/T3543.6中的高温烘干法（130℃烘干1h）测定种子含水量，并按照公式（2）进行计算。式中：W0——种子含水量；用百分数表示（％）；M1——种子鲜重，单位为克（g）；M2——种子烘后重量，单位为克（g）。化州柚种子保存量不应少于500粒。化州柚种子超低温保存的冷冻方式为分步冷冻法，即将待保存的化州柚种子在室温下放入加有玻璃化溶液（PVS2）的15mL冻存管（每管30粒种子）中，置于4℃冰箱中0.5h，取出立即放入-20℃冰柜中1h，之后迅速投入液氮中保存（液体浸泡种子即可）。PVS2的配置方法见附录A的A.3。液氮中至少冻存24h后，取出2个冻存管，立即放入40℃水浴中快速解冻2min，之后用洗涤液（DS），（每升MS溶液中含1.2mol蔗糖）浸泡5min，并用纯净水洗涤3次。DS的配置方法见附录A的A.4。取出1管解冻后的种子，按照5.1活力检测方法，进行超低温保存后的初始生活力检测。当种子生活力≥60％时视为保存成功。将剩下125℃～30℃，湿度70％～8510d～20d3附 录 A（）A.1 TTC精密称取TTC1.00g，溶于100mL磷酸盐缓冲液中，制成浓度为1％的TTC溶液，调pH至6.5～7.5，放入棕色瓶内，置于4℃冰箱备用。溶液Ⅰ：9.081溶液Ⅱ：35.81gL按Ⅰ:Ⅱ=2:3PVS2精密量取甘油23.8mL、乙二醇13.6mL、二甲亚砜13.6mL，称取蔗糖13.7g，溶于MS溶液中，定容至100mL，调pH值至5.8，高温高压灭菌，4℃冷藏。注：配置时需戴手套，并在通风厨内操作。DS精密称取蔗糖41.1g溶于MS溶液中，定容至100mL，调pH值至5.8，高温高压灭菌，4℃冷藏。4参考文献M，2015,74-75[2]中国科学院中国植物志委员会.中国植物志.第43(2)卷[M].科学出版社,2004(1997)：187[M]2004:1ReedBM.PlantCryopreservation‒APracticalGuide[M].Springer,2010:3HorYL，KimYJ，Ugap