华中农业大学博士论文答辩

博士论(Lun)文答辩草鱼核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain，NOD)基因和γ-干扰素相关基因(IFN-gammarelatedgene，IFN-γrel)的克隆及其表达

指导教师：彭克美教授聂品研究员答辩人：陈文钦

华中农业大学动物科技-动物医学学院

2010年5月30日第一页，共四十三页。答辩内(Nei)容五、课程学习及文章发表情况四、创新点及下步研究计划二、草鱼NOD基因三、草鱼γ-干扰素相关基因一、研究

背景汇报

内容第二页，共四十三页。1.概述以往为人们所熟知的PRRs主要是一些膜结合蛋白如甘露糖受体、To1l样受体、CD14和清道夫受体等，主要识别胞外环境的微生物结构成分。最近的研究发现，胞浆中也存在着识别细菌(Jun)和病毒成分的PRRs——核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)蛋白。一、研究背景第三页，共四十三页。2.NOD蛋白的组成和结构通过对人类基因数据库同源搜索，现已发现20多个成员：NOD1(CARD4)、NOD2(CARD15)、NOD3-NOD5、NALP1-14、IPAF、CIITA、NAIP等。NOD蛋白主要由三个不同的结构域组成：（1）LRR：是富含亮氨酸的重复序列，位于C端（2）NACHT：位于中央，对于NOD蛋白的寡聚体化和活(Huo)化非常重要。（3）效应结构域：位于N端，可以是1个PYD，1个或2个CARD，或者是3个BIR。一、研究背景第四页，共四十三页。NOD家族的(De)结构示意图NALP1NALP2-14NOD1NOD2CARDPYDNACHTNADLRRBIRADFIINDCIITAIPAFNAIPNOD3NOD4XNOD5一、研究背景第五页，共四十三页。3.NOD的识别作用已有研究表明，NOD1和NOD2是细胞内细菌肽聚糖的感受器，能识别细菌肽聚糖(PGN)的降解产物。NOD1识别的最小结构(Gou)是革兰氏阴性细菌的产物内消旋二氨基庚二酸(meso-diaminopimelicacid,meso-DAP)；NOD2识别细菌的最基本结构是PGN的胞壁酰二肽（muramyldipeptide，MDP）。MDP几乎存在于所有细菌的PGN中，因此，NOD2既是G+细菌也是G-细菌的感受器。

一、研究背景第六页，共四十三页。

4.NOD蛋白的信号转导在非活化状态，NOD1、NOD2的LRR和NACHT结合保持分子处于折叠状态。当NOD1和NOD2通过LRR和配体结合后可以(Yi)打开，通过NACHT自身寡聚，NOD分子的CARD和下游RICK分子的CARD结构域发生嗜同种结合，活化RICK。经过复杂的磷酸化，活化NF-κB，诱导促炎细胞因子的转录以及抗菌肽的合成。一、研究背景第七页，共四十三页。NODs介(Jie)导的信号传导通路图第八页，共四十三页。

5.NOD蛋白的生物学功能

NOD蛋白主要的生物学功能是加强机体免疫系统探测微生物感染的能力，产生IL-1β等促炎因子，调节免疫应答和炎症反应。近来的研究发现NOD蛋白除(Chu)了识别细菌产物外，还可能诱导细胞凋亡、直接参与细菌感染的控制。现在也有最新报道，证明NOD蛋白也在抗病毒免疫中起着重要作用。一、研究背景第九页，共四十三页。6.选题的目的与意义

尽管对哺乳动物胞内模式识(Shi)别受体在参与对细菌的识(Shi)别、诱导炎症反应的作用等方面进行了深入的研究，但国内外对鱼类NOD基因的研究仅有2篇报道。迄今为止，对鱼类NOD基因的结构，转录和蛋白表达的特征以及是否具有类似于哺乳动物的功能还是不清楚的。本论文拟通过对草鱼NOD1和NOD2基因的克隆以及表达分析，旨在揭示鱼类NOD基因的结构与表达特征。同时该研究为进一步研究NODs基因的功能奠定了基础。

一、研究背景第十页，共四十三页。二(Er)、gcNODs基因的克隆与表达分析1.gcNODs基因的分子特点1.1gcNOD1:

cDNA包含3215bp，ORF区域为2813bp，大约编码937个氨基酸,5′-UTR为350bp，3′-UTR为52bp。C端的LRR结构域，位置在769-791、825-851；N端有一个CARD，结构域在11-73；NOD1的NACHT结构域在186-359。第十一页，共四十三页。1.2gcNOD2:cDNA全长3130bp，编码982个氨基酸；ORF为2949bp，编码982氨基酸，5′-UTR为81bp，3′-UTR为103bp，C端LRR有7个串联(Lian)结构域；N端有两个CARD，结构域在27-81、111-200；中间NACHT结构域在271-441。二、gcNODs基因的克隆与表达分析第十二页，共四十三页。二、gcNODs基因(Yin)的克隆与表达分析草鱼NOD1草鱼NOD2草鱼NODs基因的结构示意图NACHTCARDLeucineRichRepeat第十三页，共四十三页。二、gcNODs基因的(De)克隆与表达分析2.gcNODs基因的基因组结构974968171523241319996471895524175180484848484848484124grasscarpNOD11735611271765848484848484319266147108878919090511grasscarpNOD2草鱼NOD1基因组全长9kb,由11个外显子和10个内含子组成草鱼NOD2基因组全长5kb,由10个外显子和9个内含子组成第十四页，共四十三页。二、gcNODs基因的(De)克隆与表达分析3.gcNODs基因的内含子相位12345678910gcNOD10122222222zfNOD10122222222hNOD10122222222gcNOD2012222222zfNOD2012222222hNOD2012222222表1.草鱼、斑马鱼以及人NODs基因内含子相位第十五页，共四十三页。二、gcNODs基因的克隆与表(Biao)达分析4.

gcNODs基因与其他物种NODs基因的氨基酸相同/相似性比较Full-lengthCARDsNACHTLRRszebrafishNOD181.3/86.773.1/75.692.5/95.488.2/94.9humanNOD150.2/70.938.4/54.758.0/73.057.9/78.5pigNOD151.1/71.534.9/52.358.6/74.757.9/76.9mouseNOD150.4/70.939.5/52.358.0/76.454.9/74.4Full-lengthCARDsNACHTLRRszebrafishNOD283.8/92.068.5/77.690.1/95.982.8/91.8humanNOD245.6/62.629.6/46.557.3/73.154.1/67.8pigNOD246.8/65.227.6/47.456.7/73.752.6/69.3mouseNOD247.0/64.728.5/48.459.6/74.353.0/67.0第十六页，共四十三页。二、gcNODs基因的(De)克隆与表达分析5.

gcNODs基因的分子进化树第十七页，共四十三页。二、gcNODs基因的克隆与表(Biao)达分析6.

gcNODs基因在不同组织中的组成性表达第十八页，共四十三页。二(Er)、gcNODs基因的克隆与表达分析7.

gcNODs基因在肽聚糖刺激下的诱导型表达*****第十九页，共四十三页。二、gcNODs基因的克隆与表达分(Fen)析*****8.

gcNODs基因在脂多糖刺激下的诱导型表达******第二十页，共四十三页。二、gcNODs基(Ji)因的克隆与表达分析******9.

gcNODs基因在PolyI:C刺激下的诱导型表达******第二十一页，共四十三页。二、gcNODs基因(Yin)的克隆与表达分析10.

gcNODs基因在呼肠孤病毒感染下的诱导型表达****************第二十二页，共四十三页。二、gcNODs基因的克隆与表达分(Fen)析11.

gcNOD1基因重组蛋白的表达与纯化97.466.243.031.020.114.4第二十三页，共四十三页。二、gcNODs基因的克隆与(Yu)表达分析11.

gcNOD1基因重组蛋白的表达与纯化M1234567897.466.243.031.020.1第二十四页，共四十三页。二、gcNODs基因的克隆(Long)与表达分析12.

gcNOD1蛋白的免疫组化ABCDEF第二十五页，共四十三页。二、gcNODs基因(Yin)的克隆与表达分析13.小结（1）首次从鱼类中克隆了NOD1和NOD2基因，氨基酸的排列、基因组结构以及内含子相位的分析都显示了NOD1和NOD2在进化上具有很强的保守性；（2）荧光定量分析显示草鱼的NOD1和NOD2基因呈广泛的组成性表达分布，在所检测的组织中都可以检测到表达；第二十六页，共四十三页。二、gcNODs基因的克隆与表达(Da)分析（3）来自革兰氏阳性菌的PGN对草鱼NOD1的表达在大多数组织中没有显著的作用；（4）在LPS刺激下，gcNOD1的诱导表达特征与gcNOD2相似；（5）polyI:C和病毒感染也能诱导gcNOD1和gcNOD2的表达。第二十七页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基(Ji)因的克隆与表达分析1.gcIFN-γrel基因的分子特点

IFN-γrel基因的cDNA包含861bp，其中5-UTR长39bp，ORF长504bp编码167个氨基酸，3-UTR长316bp。3-UTR富含AT（75.2%），一个潜在的多腺苷酸加尾信号（AATAAA)位于poly[A]尾上游13bp。第二十八页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的克隆与(Yu)表达分析AAATTCGCTTGGTTCACAGCACCAAAACACAAACACAAAGAATGGATTCTTGGCTCAACAMDSWLNTGATGCTGCTGTGTGGACTTCTGTTAATAGCATCTCTTCAGACAACCAACGCTTTCAGATMMLLCGLLLIASLQTTNAFRTTCGACGGTCCAAAAGCGAGATGACCCATTTGGAGACAAATATCCACTCTCTGCAAGAACFRRSKSEMTHLETNIHSLQEATTATgtaagtgatgtctactatcatgaacttcagcagggggtttgaaagcaactcttgtHYctgtgttaacaagatgaatcacttcaagtcctactcatatctgtatgttatagtttggtcttgcggctaatattagcaagaagagacctattgcacaataaatttcacgaaactttgttcttagattaggagttaagattcaccagagatgcacattcattcataacgtttgctgttttttgcccgctttctttagAAAACACGTGGCACAGAATGGGTTTCAAAGTCTGTTTTTGTTCCKTRGTEWVSKSVFVPTCATCTGAACCAGCTGAATgtaagtttttactgtgcaaaatgctaaaatattaaaatgcaHLNQLNactgaatgatatatatgcctctatatatgtatcatgctaataatacttgtttctcttagTCCAAGGCTTCCTGCACTTGTCAGGCGCTGTTGCTTGAAAGAATGCTGAACATCTACGAAGSKASCTCQALLLERMLNIYEAACTTTTCCAAGACATGAAGTCTGAGCATAAAGAAGGGAGAAAAGATCTAGACCATCTAAELFQDMKSEHKEGRKDLDHLTGGATGAGGTGAAAAAGCTGAGGGGAAATTATAAGGAAGAACATAAAGTATGGAAAGAGCMDEVKKLRGNYKEEHKVWKETTCAGGAAATGAACTCAGTCAAGgtaaacattaagagaaagtcctgtcttcattgtgaatLQEMNSVKgtgtacattttgagttattgaattgctgtttatcatatgatatcaggtcaggtgatataatatatgatatggtactgtatctaatacaaatatttgtcctcactctcacaagGTGAAAAAVKTGGAACAATCCGAGGAGGAGCATTAAATGACTTTCTCATGGTGTTTGATCGGGCCTCTACNGTIRGGALNDFLMVFDRAS

AGAAAAACACAAAAAGGTTCAATGAGAAGATCCAAAAGTCATGTCTTTCATTTAGTAAACTEKHKKVQ*TTGCGCTTTGTTATTGTGTTAGCCTATTTATTTATAAATTATATGGAAATAATTATTTATTTTTAACTTTATAATGTACTCTACTACACCATCCATAACTTATAATCTAACTTATTCTCATCACAAGTGTGTTTGCATCATTTACAGTGTACAGAAACGATGAACGTTGATTTCTAACTGGATTTGCTTGAAATATTCTGTGAGCTTCACTGGCTAAATGTTTAATTACAATAAATTAATTTTGCATTAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAA

草鱼γ-干扰素相关基因的cDNA与基因组序列第二十九页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的克隆与表达(Da)分析2.gcIFN-γrel基因与其他物种γ-干扰素与γ-干扰素相关基因同源性比较SpeciesAminoacididentity/similarity(%)CatfishIFN-γrel37.8/63.2ZebrafishIFN-γrel62.9/77.6CarpIFN-γrel50.0/71.9ZebrafishIFN-γ19.8/44.3GoldfishIFN-γ21.7/44CodIFN-γ20.6/44.3CatfishIFN-γ21.8/48.3CarpIFN-γ20.7/41.4FuguIFN-γ17.7/40.7TroutIFN-γ119.4/48.9TroutIFN-γ221.5/50.6SalmonIFN-γ21.9/52.8第三十页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的克隆与表(Biao)达分析3.gcIFN-γrel基因与其他硬骨鱼类γ-干扰素与γ-干扰素相关基因的系统发育关系第三十一页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的克隆与(Yu)表达分析4.gcIFN-γrel基因的组织表达第三十二页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的克隆(Long)与表达分析5.gcIFN-γrel基因在脂多糖和PolyI:C刺激下的诱导性表达****LPS****polyI:C第三十三页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的克隆(Long)与表达分析6.

PGN的刺激对草鱼IFN-γrel、NOD1和NOD2表达的影响第三十四页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的(De)克隆与表达分析7.

gcIFN-γrel基因在呼肠孤病毒感染下的诱导型表达*******第三十五页，共四十三页。三(San)、gcIFN-γrel基因的克隆与表达分析8.小结(1)序列分析显示本研究所克隆的gcIFN-γrel基因是一个

与斑马鱼、鲶鱼和鲤鱼中IFN-γrel基因同源的基因，而不是那个早已存在的IFN-γ基因；(2)与哺乳类和鲑鳟的IFN-γ不同的是，从20条不同来源的草鱼的序列分析显示，gcIFN-γrel在它的内含子中缺乏多态性微卫星序列；第三十六页，共四十三页。三、gcIFN-γrel基因的克隆与表达分(Fen)析(3)gcIFN-γrel呈广泛的组成性表达；(4)聚肌胞甘酸(polyI:C)，一种模拟病毒双链RNA而合成的dsRNA，能上调gcIFN-γrel基因的表达;(5)在所分析的四个组织中，gcIFN-γrel的表达规律与gcNOD2相一致；推测IFN-γ和IFN-γrel被细菌的产物PGN所激活可能是通过NOD2依赖的方式。第三十七页，共四十三页。四、创新点及下步研(Yan)究计划1.主要创新点

（1）首次从草鱼中克隆了胞内识别细菌的模式识别受体NOD1和NOD2基因的cDNA全长和基因组全长；（2）对草鱼胞内模式识别受体NOD1和NOD2从mRNA水平、蛋白水平及细胞水平进行了表达或定位分析；同时，首次研究了病毒的感染对细菌模式识别受体NOD1和NOD2基因表达的影响；（3）克隆了草鱼IFN-γ相关基因的cDNA全长和基因组全长，并对该基因的表达规律进行研究；首次提出了草鱼IFN-γ相关基因与NOD样模式识别受体在发挥功能上存在相关性。第三十八页，共四十三页。2.下步研究计划

（1）研究NOD样模式识别受体对细菌成分的识别以及在病(Bing)毒