基因的重组与转移

关于基因的重组与转移第1页，共40页，2023年，2月20日，星期三一、什么是受体细胞（receptorcell）?第一节受体细胞又称hostcell，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定遗传的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。显然并不是所有细胞都能作为受体细胞第2页，共40页，2023年，2月20日，星期三二、受体细胞的选择应符合哪些基本原则？九大原则！第3页，共40页，2023年，2月20日，星期三1、便于重组DNA分子的导入。2、能使重组DNA分子稳定的存在于细胞中3、便于重组体的筛选。4、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长5、安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染6、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。7、受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性8、具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达。9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。第4页，共40页，2023年，2月20日，星期三三、目前常用的受体细胞？这些受体细胞各有哪些特点？1、大肠杆菌2、枯草杆菌3、蓝细菌4、棒状杆菌5、链霉菌原核生物细胞6、酵母菌7、植物细胞8、动物细胞真核生物细胞第5页，共40页，2023年，2月20日，星期三原核生物细胞？这是较为理想的受体细胞类型！没有坚硬的细胞壁原因没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质基因组简单，不含线粒体基因组培养简单、繁殖迅速，实验周期短，重复实验快第6页，共40页，2023年，2月20日，星期三原核生物细胞？原核生物细胞作为受体存在的缺陷！不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统原因缺乏真核生物的蛋白质加工系统存在内源性蛋白酶第7页，共40页，2023年，2月20日，星期三真菌细胞—酵母菌外源真核基因最理想的表达系统基因表达调控机理比较清楚优势具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统不含有特异性的病毒，不产生毒素培养简单、利于大规模发酵生产，成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中第8页，共40页，2023年，2月20日，星期三植物细胞优势具有全能性第9页，共40页，2023年，2月20日，星期三动物细胞用于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等能识别和除去外源真核基因中的内含子优势真核生物蛋白翻译后能被正确加工或修饰易被重组DNA质粒转染可将表达产物分泌至培养基中组织培养技术要求高缺点第10页，共40页，2023年，2月20日，星期三研究性作业题目：国内外利用不同受体细胞开发生物反应器的研究进展情况基本内容要点：1、目前国内外都开发了哪些受体细胞作为生物反应器，并分别用它们生产了哪些基因工程产品？为什么要选择它作为生产该产品的反应器？2、生物反应器这一领域目前存在哪些问题？将来发展趋势如何？3、目前，国内外有哪些从事生物反应器开发的企业？你认为如果今后你去这里求职应该从知识上做哪些储备？要求：中文参考文献不少于20篇英文参考文献不少于5篇第11页，共40页，2023年，2月20日，星期三第二节重组体导入受体细胞一、重组DNA分子转入原核生物细胞二、重组DNA分子转入真核生物细胞第12页，共40页，2023年，2月20日，星期三一、如何将重组DNA分子转入原核生物细胞？以大肠杆菌为例转化途径转导途径第13页，共40页，2023年，2月20日，星期三什么是转化（transformation）？重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。第14页，共40页，2023年，2月20日，星期三格里菲斯的肺炎双球菌转化实验（Diplococcuspneumoniae）,1928

爱弗莱证实转化物质是DNA第15页，共40页，2023年，2月20日，星期三感受态（competent）：细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA，并使其基因型和表型发生相应变化的能力。感受态细胞：能够吸收DNA的细胞。第16页，共40页，2023年，2月20日，星期三1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备第17页，共40页，2023年，2月20日，星期三2.菌种的选择野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞1）、hsdR-2）、recA-

recB-

recC-3）、易于转化或转导4）、有明显的选择性差异5）、感染寄生缺陷型实验室常用菌株JM109，DH5α，Top10，DH10BHB101第18页，共40页，2023年，2月20日，星期三用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第19页，共40页，2023年，2月20日，星期三4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬第20页，共40页，2023年，2月20日，星期三（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第21页，共40页，2023年，2月20日，星期三每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.转化方法2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法第22页，共40页，2023年，2月20日，星期三10ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置10分钟42ºC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法第23页，共40页，2023年，2月20日，星期三LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法第24页，共40页，2023年，2月20日，星期三4.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜第25页，共40页，2023年，2月20日，星期三环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒5.影响转化率的因素第26页，共40页，2023年，2月20日，星期三①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competentcells)第27页，共40页，2023年，2月20日，星期三把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。6.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。第28页，共40页，2023年，2月20日，星期三转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。第三节外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞1.菌株选择如：ura3-52,trp1-289,leu2-3,leu2-112,his31第29页，共40页，2023年，2月20日，星期三（1）利用原生质球进行转化2.酵母的转化方法

酵母原生质体感受态酶去壁CaCl2、PEG插入外源基因的酵母载体PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。转化第30页，共40页，2023年，2月20日，星期三

酵母0.1mol/LLiCl处理插入外源基因的酵母载体感受态40%PEG4000（2）利用Li+盐进行转化第31页，共40页，2023年，2月20日，星期三叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗二、导入植物细胞1.叶盘法（leafdisk）第32页，共40页，2023年，2月20日，星期三植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)第33页，共40页，2023年，2月20日，星期三又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m钨弹头吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）4.农杆菌（agrobacterium）介导第34页，共40页，2023年，2月20日，星期三（1）原理：三、导入哺乳动物细胞1.磷酸钙沉淀法HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收DNA沉淀。第35页，共40页，2023年，2月20日，星期三不需要载体。（2）特点：第36页，共40页，2023年，2月20日，星期三脂质体有商业试剂盒（如LifeTechnologies）。2.脂质体（lipofectin）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。第37页，共40页，2023年，2月20日，星期三直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，