生物显微技术 第二章 切片的制作

生物显微技术第二章切片的制作第一页，共二十八页，2022年，8月28日石蜡切片的过程动物的处死动物组织取材固定组织固定后的处理脱水和透明包埋切片第二页，共二十八页，2022年，8月28日一、动物的处死麻醉空气栓塞颈椎脱臼或断头股动脉放血第三页，共二十八页，2022年，8月28日二、动物组织取材动物组织取材原则：尽量保持组织的生活状态。动作要快不要过度用力夹捏组织，防止组织变形。第四页，共二十八页，2022年，8月28日三、固定1、目的：尽量保持组织的生前状态，防止组织的死后变化、自溶。保持细胞和组织原有的形态结构，保持组织内部成分特征不发生变化。2、方式：浸入式灌注式第五页，共二十八页，2022年，8月28日灌注式此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。然后取材，投入固定液。灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。第六页，共二十八页，2022年，8月28日3、固定液醛类固定剂非醛类固定剂丙酮及醇类固定剂第七页，共二十八页，2022年，8月28日醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联。包括：甲醛、多聚甲醛、戊二醛通常与其他的试剂联合使用优点是对组织穿透性强，收缩性小。可以保存蛋白质、脂肪、黏液物质以及一定量的糖原。缺点：长期固定使组织过度硬化及细胞核不着色，并且产生“福尔马林色素”，它是由于血红蛋白与甲醛转化的酸形成正铁血红素。第八页，共二十八页，2022年，8月28日非醛类固定剂氯化汞（HgCI2）：蛋白的强固定剂重铬酸钾：保存类脂、高尔基复合体、及染色体等结构。苦味酸：三硝基苯酚，蛋白、糖原固定剂，醋酸：固定染色体。软化组织，缓解收缩。蔗糖：防止某些细胞成分扩散，保持酶活性，良好形态。四氧化锇：保存细胞蛋白质细微结构有良好效应，应用与电镜观察切片的固定与染色。第九页，共二十八页，2022年，8月28日丙酮及醇类固定剂丙酮：沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强。可以单独使用，低温下保持酶活性效果好。乙醇：固定糖原和核酸的作用。低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差。必须与其他试剂混合使用，单独使用使组织收缩严重，对细胞形态保存不良。第十页，共二十八页，2022年，8月28日混合固定剂固定组织时，单独使用一种固定剂很难对组织成分有理想的固定效果。通常几种固定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。第十一页，共二十八页，2022年，8月28日4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4成分：4%多聚甲醛溶于1倍的磷酸缓冲液中，1倍的磷酸缓冲液:PBSMV

NaCl140mM58.44KCl2.7mM74.55NaH2PO4•12H2O，10mM358.14KH2PO41.8mM136.09

调pH至7.4。

第十二页，共二十八页，2022年，8月28日Bouin’s液苦味酸饱和水溶液75ml15固定糖原37%-40%福尔马林液25ml5固定蛋白和脂肪冰醋酸5ml1凝固核染色质第十三页，共二十八页，2022年，8月28日固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。第十四页，共二十八页，2022年，8月28日固定时间的选择不同的研究目的所需使用的固定液。材料的大小，组织的特性与致密度。温度的不同有所差别。第十五页，共二十八页，2022年，8月28日组织固定后的处理冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。修块:大小合适、去除形态不好的部分，第十六页，共二十八页，2022年，8月28日四、脱水脱水目的：运用某种溶剂置换组织内的水分。脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等第十七页，共二十八页，2022年，8月28日乙醇：最常用的脱水剂一般组织：70%---80%----90%--100%---100%特殊组织：30%--40--%--50%---60%---70%---80%---90%--100%---100%每步30分钟左右。要求：完全脱净，保证脱水梯度和每一步脱水时间

不能过度脱水（使组织变脆）不同组织脱水时间不同：大的致密的组织需要延长脱水时间为加速各级酒精的穿透力，脱水可在37℃温箱中进行。

第十八页，共二十八页，2022年，8月28日五、透明或媒浸目的与作用对组织的最后脱水处理与包埋剂置换透明剂：苯、甲苯、二甲苯、氯仿等有机溶剂100%乙醇脱水后进入二甲苯两次，保证透明完全。第十九页，共二十八页，2022年，8月28日六、包埋包埋剂的特点：具有一定的强度和韧度，满足切片的要求。能完全进入组织。对组织内部成分损伤小。第二十页，共二十八页，2022年，8月28日石蜡包埋石蜡特点：熔点：45-50℃软蜡

55-60℃硬蜡常用石蜡的处理：新蜡应溶一次，增加密度。并用滤纸过滤去处杂质。加5%~10%的蜂蜡,增加石蜡的韧性。反复溶的旧蜡包埋效果更好。程序：在溶蜡箱中进行55-60℃，恒温。浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯：石蜡（1：1）中两次，在石蜡中两次，每次一个小时左右。包块：在室温进行第二十一页，共二十八页，2022年，8月28日第二十二页，共二十八页，2022年，8月28日第二十三页，共二十八页，2022年，8月28日七石蜡切片载玻片处理：切片：展片：背面与玻片。烘片：37℃的温箱内烤干(约需12小时)。第二十四页，共二十八页，2022年，8月28日优点：操作比较简便、容易，可以切出较薄的切片，并且易于制成连续切片，也容易附着于载玻片上。缺点：是不适于较大的标本，材料在经过脱水、浸蜡的过程中容易收缩。第二十五页，共二十八页，2022年，8月28日火棉胶切片法透明剂：乙醚与乙醇等量混合包埋剂：火棉胶溶于透明剂包埋：常温进行凝固：在乙醚中过夜，在氯仿中过夜。在70%乙醇中保存。第二十六页，共二十八页，2022年，8月28日优点：可切大的组织可切较硬的组织如硬骨缺点：操作所用