丝状真菌遗传

丝状真菌遗传第1页/共69页

第二节

构巢曲霉(非顺序排列四分体)的遗传分析在构巢曲霉(A.nidulans)中，一次减数分裂的全部产物虽然也同处于一个子囊内，但是其子囊孢子不象粗糙脉孢菌那样呈直线排列，而是无顺序的排列。我们将这种不是以直线方式排列在一个子囊内的四个减数分裂产物称为非顺序排列四分体。一、构巢曲霉的生活史构巢曲霉的有性生殖是通过同宗接合的方式进行的，其生活史见图。

第2页/共69页第3页/共69页二、构巢曲霉有性杂交的遗传分析构巢曲霉有性杂交产生的是非顺序排列的四分体，无法判断它们是属于第一次分裂分离还是第二次分裂分离，因此在粗糙脉孢菌中适用的通过第二次分离子囊数来计算着丝粒距离的方法，在构巢曲霉有性杂交中不适用。但把四分体归纳为PD、NPD何T三种类型时，是以四分体中子囊孢子性状的组合方式划分的，没有考虑四分体中孢子的排列顺序。所以在构巢曲霉有性杂交中可采用四分体中PD、NPD和T的出现频率来进行遗传分析。另外，也可用随机孢子分析法来进行分析。Pontecorvo等人将pabyBIO与PABYbio株杂交，随机地挑取2个子囊果，来检查重组型的出现情况，其结果如表所示。第4页/共69页

表pabyBIO×PABYbio杂交结果杂交pabyBIO_____________________ab_______________________PABYbio

基因型ⅠⅡ总计交换部位

pabyBIO144117261―PABYbio156125281―pabYbio422062aPAByBIO392463apabybio11516bPABYBIO102232bpabYBIO011a，bPABybio235a，b

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Ⅰ和Ⅱ为所检测到的子囊果号；pab为对氨基苯甲酸；y为黄色突变株；bio为生物素第6页/共69页根据：

重组染色单体数目2T+4NPD

重组频率=______________________________×100%=__________________________×100%

染色单体总数目4(T+PD+NPD)

由表所示结果，计算如下：

62+63+1+5pab-y重组率=______________________________________________________×100%=18.2%261+281+62+63+16+32+1+5

16+32+1+5y-bio重组率=______________________________________________________×100%=7.5%261+281+62+63+16+32+1+5

62+63+16+32pab-bio重组率=______________________________________________________×100%=24%261+281+62+63+16+32+1+5

第7页/共69页因此，供试的三个基因在染色体上的排列为：

_____pab_______________y_________bio__________

第8页/共69页第三节

真菌的准性生殖(parasexualcycle)

如前所述，真菌在进行有性循环时，通过减数分裂可产生重组体，是实现基因重组的一条重要途径。但是有很多真菌，特别是半知菌亚门的真菌，没有或很少发生有性生殖过程，却仍然表现出了较高频率的变异，这种变异就是通过另一条独立于有性生殖的基因重组途径_____

准性生殖。准性生殖是真菌的一种导致基因重组的过程，包括异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单元化。一、准性生殖的普遍性在20世纪50年代初，科学家在对构巢曲霉的研究中，发现了准性生殖。后来，各国的研究者先后在21个属、40个真菌中证实了准性生殖过程的发生(表)。第9页/共69页

表已知发生准性生殖的真菌粘菌纲(Acrasiomycetes)担子菌纲(Basidiomycetes)Dicrysteliumdiscoideum

黑粉菌属(3个种)(Ustilago)

柄锈菌属(3个种)(Puccinia)

藻状菌纲(Phycomycetes)亚麻珊锈菌(Melampsoralini)

布拉克须霉(Phycomycesblakesleeanus)鬼伞属(4个种)(Coprinus)

裂褶菌(Schizophyllumcommune)

子囊菌纲(Ascomycetes)

曲霉属(9个种)(Aspergillus)半知菌纲(Deuteromycetes)

青霉属(3个种)(Penicillum)尖镰孢菌(Fusariumoxysporum)酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)轮子孢属(2个种)(Verticillium)栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)头孢霉属(2个种)(Cephalosporium)

禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)腐质霉(Humicolasp.)

小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)不全壳二孢属(Ascochyraimperfect)

柄孢壳菌(Podosporaanserina)Pyriculariaoryzae

粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)

第10页/共69页二、准性生殖的过程

准性生殖过程包括异核体的形成、体细胞二倍体的产生以及体细胞中染色体的交换和单倍化。下面就这三个阶段分别进行讨论。(一)异核体的形成当带有不同遗传性状的两个单倍体细胞或菌丝相互融合时，会导致在一个细胞或菌丝中并存有两种或两种以上不同遗传型的细胞核，这样的细胞或菌丝就叫异核体。异核体的形成是进行准性生殖的第一步。由于准性生殖首先是在构巢曲霉中发现的，所以下面以构巢曲霉为例来说明。第11页/共69页

当把构巢曲霉A接合型的亮氨酸缺陷突变株(leu–met+)与A接合型的蛋氨酸缺陷型突变株(leu+met-)混合接种在基本培养基上培养时，常常可以产生少量原养型菌落，这些菌落是异核体。这是因为两个亲本的菌丝间发生相互联结，形成了细胞质和细胞核相互混杂的异核体。在异核体中两种细胞核能彼此提供所缺少的酶，因此可不需亮氨酸和蛋氨酸而在基本培养基上生长。第12页/共69页1．异核体的证实我们知道，将两个营养缺陷型菌株混合培养，出现原养型菌落的原因可能是由于互养、异核体、二倍体或单倍重组体的存在。如何证明上述情况是由于异核体所致呢？(1)互养这一解释的排除为了排除互养的存在，人们将原养型菌落上取下的少量菌丝接种于养料贫乏的培养基上。在放大镜下将从接种处向外长出的菌丝的尖端连同小块培养基切下，放在基本培养基上。如果原养型菌落的出现是由于互养所致，那么单个菌丝尖端就不会生长。可是只要割取的菌丝尖端不是太短而妨碍生长，往往可以得到一个新的培养物，因此可以排除互养这一解释。第13页/共69页(2)二倍体或单倍体的排除为了排除二倍体和单倍重组体的存在，可将leu–met+株和leu+met–株的分生孢子混合接种在基本培养基上，取出其上长出的菌落的单个菌丝尖端，接种于基本培养基上，得到由单个菌丝尖端所长成的培养物。收集该培养物上的孢子，分别接种于基本培养基、含亮氨酸培养基和含蛋氨酸培养基上，经培养发现在前一种培养基上没有菌落，而在后两种培养基上可出现菌落由于构巢曲霉的分生孢子是单核的，所以由异核体产生的分生孢子的核型应分属于leu–met+株或leu+met–，所以它们在基本培养基上不生长，而能在后两种培养基上生长。而二倍体(leu–met+/leu+met–)和重组单倍体(leu+met+)能在基本培养基上生长，而实验结果与此相反，所以上述原养型菌落的出现并非二倍体和单倍重组体所致。从而说明了上述原养型菌落确实是异核体。第14页/共69页2．异核体的生物学意义异核现象在自然界普遍存在。早在1938年就已在35属的半知菌中发现32属有异核现象。异核现象在自然界这样普遍的一个原因是异核体包含着不同基因型的细胞核，具有生长优势，另外是具有更好的环境适应能力。此外，异核体在遗传分析中也很重要，由于异核体内的两个不同营养缺陷型的细胞具有互补作用，因此可以用异核体进行基因等位性的测定等研究。一般地说，异核体的形成与A、a接合型之间没有关系，但接合型可影响形成异核体的难易程度，相同接合型的菌株间更容易形成异核体。异核体的形成是由基因型决定的，在粗糙脉孢菌中已发现至少有10个基因与异核体的形成有关。

第15页/共69页(二)杂合二倍体的形成异核体细胞中存在着核融合的可能。核融合是指两个单倍体核融合形成一个二倍体核的现象。基因型相同的核融合形成纯合二倍体，基因型不同的核融合形成杂合二倍体。异核体中两个基因型不同的细胞核可以以极低的频率融合成杂合二倍体。研究表明异核体发生核融合而产生二倍体的频率为10-7—10-5。用某些理化因素(如紫外线、樟脑蒸气或高温)处理，可提高二倍体产生的频率。原因可能是由于在处理过程中使某些抑制核融合的基因发生突变的结果。如果把大量的异核体所产生的分生孢子菌株在基本培养基上，就可以得到少数菌落。这些菌落不同于第一次混合接种leu-met+

株和leu+met-株的孢子在基本培养基上所出现的原养型菌落，因为从现在得到的少数菌落上取得的分生孢子都能在基本培养基上形成菌落。可见这些菌株是二倍体菌株而不是异核体。下面以构巢曲霉为例，来介绍二倍体的特征。第16页/共69页1956年，Pontecorvo等人在用构巢曲霉白色突变株(w-y+)和黄色突变株(w+y-)进行异核体的研究时发现，在培养基中可产生形成绿色孢子的菌株。根据前面谈到的有关内容，可知由异核体(w-y+//w+y-)所产生的孢子应该是白色和黄色两种，那么绿色的孢子是怎样形成的呢？经研究发现该绿色的分生孢子并不稳定，在使之形成大菌落时，常常会以很低的频率出现白色或黄色的扇形面­­---角变。另外，形成绿色分生孢子的菌株的细胞内只有一个核，且其DNA的含量为亲本DNA含量的2倍。因此，人们认为绿色分生孢子的形成是由于异核体中的两个核融合而形成二倍体(w-y+/w+y-)的缘故。由于白色突变型和黄色突变型对于绿色野生型来讲都是隐性的，所以二倍体的分生孢子必然呈绿色。

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那么二倍体有什么特性呢？由表可以看出，构巢曲霉、黑曲霉等的二倍体分生孢子大于单倍体的分生孢子；并且在酱油曲霉中，尽管分生孢子的大小是一样的，但每个分生孢子中核的数目是不相同的,二倍体分生孢子中核数约为单倍体分生孢子的一半。

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表几种真菌分生孢子特性的比较单倍体分生孢子二倍体分生孢子

直径(um)体积(um3)核数/孢子直径(um)体积(um3)核数/孢子构巢曲霉3.1516.31.04.033.51.0

黑曲霉4.547.71.05.433.51.0

酱油曲霉―135.04.22―128.02.21

米曲霉――3.5――1.9

产黄青霉3.726.91.04.961.91.0

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根据杂合体细胞二倍体的特性，不难将它们与异核体菌落及回复突变产生的原养型菌落区别开来。一般通过测定培养特征、稳定性、分生孢子核型、分生孢子大小及DNA含量和采用双标记菌株实验，即刻排除异核体、单倍体和回复突变。第20页/共69页(三)

体细胞交换和单元化准性生殖循环过程中产生的二倍体并不象有性生殖过程中的二倍体那样进行减数分裂，它们仍以有丝分裂的形式增殖。从稳定性来看，二倍体细胞比异核体较为稳定。从异核体所取得的分生孢子属于两个亲本菌株，从二倍体得到的分生孢子则一律都是二倍体。可是稳定性是相对的，正像从异核体中可以得到少数二倍体犯不着一样，从大量的二倍体分生孢子中也可以得到少数体细胞分离子。所谓分离子包括重组体和非整倍体或单倍体。产生非整倍体或单倍体的过程称为单元化，产生重组体的过程称为体细胞交换。第21页/共69页

例如，从二倍体w-y+/w+y-株中分离出分生孢子为白色和黄色的菌株，并且发现它们都具有2n的细胞核，认为它们是由于2n核在有丝分裂过程中发生了体细胞重组，从而引起了绿色→白色、绿色→黄色的变化。也就是说，二倍体w-y+/w+y-的孢子是绿色的，重组体w-y+/w-y-的的孢子是白色的，重组体w+y-/w-y-的孢子是的孢子是黄色的。那么，体细胞重组体是如何产生的呢？经研究发现，体细胞重组体的出现是由于在有丝分裂过程中同样染色体间发生染色体交换，从而导致部分基因的纯合化。如图所示，二倍体AbCd/aBcD在有丝分裂过程中，由于同源染色体间发生交换，结果出现了AbCd/aBCd、AbcD/aBcD、AbcD/aBCd等重组体。从中可以看出，在AbCd/aBCd重组体中，C、d基因呈纯合状态；同样在AbcD/aBcD重组体中，c、D呈纯合状态。当然，如果在进行有丝分裂过程中部发生同源染色体交换的话，二倍体AbCd/aBcD细胞的子细胞仍都是AbCd/aBcD。第22页/共69页第23页/共69页

此外，研究发现二倍体细胞在有丝分裂过程中通过产生非整倍体或单倍体---单元化过程亦可形成重组体(图)。在正常的有丝分裂中，染色体一分为二，各自在纺锤丝的作用下趋向细胞的一极，使子细胞中各含义条染色体。由于纺锤丝断裂或其它原因会造成染色体不分离，使分裂后的两条染色体都趋向一极，结果是一个细胞缺少一条染色体(2n―1)，而另一细胞多了一条染色体(2n+1)，它们都是非整倍体。

2n+1非整倍体亦称为三体，在有丝分裂过程中常会失去一条染色体而成为二倍体。经过这一过程，杂合二倍体就可以转变成纯合二倍体(图的上部)。2n―1非整倍体亦称为单体，在有丝分裂过程中常常会进一步失去其它的染色体而最终成为单倍体。经过这一过程，杂合二倍体就可以转变成ABC、ABc等各种单倍体(图的下部)。第24页/共69页第25页/共69页

根据数以千计的分离子的分析，发现在准性生殖过程中异核体产生二倍体的概率是10-6，二倍体产生单倍体的概率是10-3，二倍体核中发生体细胞交换的概率是10-2。体细胞交换和单元化是两个独立发生的事件，二者发生在同一细胞中的概率很小，同一染色体上发生两次交换的概率同样很小。综上所述，在准性生殖过程中，体细胞交换和单元化是两个独立发生的。体细胞交换产生部分基因纯合化的二倍体的重组体，而单元化过程则产生各种类型的非整倍体和单倍体的重组体。因此，可以通过体细胞重组和单元化过程进行有丝分裂定位。第26页/共69页

第四节

丝状真菌的遗传物质和基因表达调控

真菌的遗传物质包括5种成份:染色体基因、线粒体基因、质粒、转座因子及病毒基因。一、染色体和基因组结构1.染色体除过丝状真菌基因组含有较少的(约为2～5%)重复DNA序列外，丝状真菌的核基因组和线粒体基因组及其结构功能与高等真核生物类似。丝状真菌单倍体通常含有6～8个线状染色体，基因组大小平均为2×107～4×107bp。真菌的基因也含内含子，但一般较短，大约50～200bp。第27页/共69页

粗糙脉孢霉单倍体基因组为4.3×107bp，G+C含量为54%,每条染色体的大小为4～10.3Mb。端粒与人的端粒相同。线粒体内含有质粒。已经鉴定了2000多个不同的粗糙脉孢菌基因，目前正在构建基因组的物理图谱，德国和美国的科学家及其单位正在进行基因组测序。第28页/共69页2.核基因组结构丝状真菌中功能相关的结构基因一般是不连锁的、分散存在于基因组中。但也有一些如与脯氨酸代谢有关的4个基因、与奎尼酸代谢有关的7个基因以及有关青霉素生物合成的3个基因是连锁的，聚集在一起构成基因簇，前两个基因簇同时还包含结构基因和调节基因。基因簇中所有各基因都是分别产生各自的mRNA，并不象原核生物那样形成操纵子结构。

1989年在自然界分离的粗糙脉孢菌菌株中发现了丝状真菌的第一个转座子Tad，该转座子全长7kb，在核基因组中以多拷贝存在，插入DNA时产生靶序列的重复。后来，在其它真菌如尖镰刀菌中也发现了转座因子，而且发现转座子与植物病原菌的致病和培养性状的高度变异有关。第29页/共69页3.线粒体基因组丝状真菌线粒体是大小为几十个kb的环状结构，它含16S和23SrRNA基因和20多个tRNA基因，还有几个与电子传递链有关的结构基因。此外，还还有一些尚未鉴定的ORF。线粒体基因组在正常复制过程中经常发生分子内重组，造成基因组大小的多变。重组的内容和方式有多种，如线粒体DNA重排、DNA片段的插入或缺失。还有因内含子剪接不同造成基因内所含内含子数目不等等。第30页/共69页二、基因结构(1)启动子许多丝状真菌基因的5’非编码区存在高等真核生物基因启动子中普遍具有的CAAT和TATA盒。但有许多丝状真菌基因并不含上述保守序列。(2)上游激活序列上游激活序列是与激活蛋白结合的部位。在粗糙脉孢菌奎尼酸代谢(qa)基因簇中，qa-1F编码的激活蛋白能与该基因簇中5个结构基因的5’非编码区结合，并对转录起激活作用。第31页/共69页(3)增强子缺失分析发现粗糙脉孢菌的am基因(编码谷氨酸脱氢酶)受两个5’上游远距离序列的调节，一个序列在转录起始点上游1.4kb，另一个在上游2.1～3.2kb之间。当同时缺失这两个序列时，只保留5～16%的表达水平，推测这两个序列可能是弱的增强子。第32页/共69页三、基因表达的调控随着分子生物学研究方法在丝状真菌研究中的应用,已经开展了对丝状真菌基因的表达及其调控全方位的研究，并取得了一定的进展。如在抗生素生物合成的基因簇结构、基因表达调控；分生孢子形成的结构基因及其分生孢子发育过程中基因表达的时空秩序性；参与营养物质代谢的基因及其表达调控等方面已做了较深入的研究工作。下面以粗糙脉孢菌奎尼酸代谢为例，阐述其调控机制。第33页/共69页

粗糙脉孢菌的qa基因簇（奎尼酸代谢基因簇）粗糙脉孢菌的qa基因簇包含5个结构基因和2个调节基因，全长18kb(图)。5个结构基因从左到右依次是:qa-X、qa-2、qa-4、qa-3和qa-Y；2个调节基因分别是qa-1F和qa-1S。这2个调节基因qa-1F和qa-1S，分别编码激活蛋白和阻遏蛋白，在无奎尼酸时这2个基因属于低水平的组成型表达。

5个结构基因的转录受奎尼酸的协同诱导，同时受qa-1F和qa-1S的协同调节，诱导时的转录水平比无诱导时高50～1000倍。所有qa基因簇(包括结构基因和调节基因)的转录都需要qa-1F编码的蛋白的激活。无诱导物时，qa-1S编码的阻遏蛋白与激活蛋白结合，阻止了qa-1F基因的转录，从而使qa结构基因及其qa-1S基因的转录受阻，仅维持在基础水平的转录。第34页/共69页第35页/共69页

有诱导物时，诱导物与阻遏蛋白结合，使qa-1F基因脱阻遏，产生的激活蛋白促进qa结构基因的转录，与此同时也促进qa-1S的转录，因此一旦诱导物水平下降，已逐渐积累的阻遏蛋白便可立即将整个系统关闭。在qa基因簇中共有13个激活蛋白的结合部位，该部位是部分对称的16bp的保守序列GGATAANNNNTTATCC，说明有些基因启动子上游有1个以上的激活蛋白结合部位。第36页/共69页四、丝状真菌的接合型基因已经对多数丝状子囊菌和担子菌的接合型基因进行了克隆和特征分析。接合型基因的名称现在倾向于统一用MAT来表示，但对于个别旧的称呼仍然延用。粗糙脉孢菌的接合型有A和a两种类型,mata的长度为3235bp，含有一个ORF,即mat–a1，编码382个氨基酸；matA的长度为5301bp，含有3个ORF，即matA-1、matA-2和mat

A-3,它们编码的产物的氨基酸长度分别为293、373和324(图)。mata和matA这两个DNA区段并无同源性，但它们两侧的DNA序列是相同的。mata和matA这两个不同的DNA区段在单倍体细胞中对应的相同的染色体上占据着相同的位置，被叫做二极性(idiomorphs)，而不叫等位基因。

mata-1和matA-1是细胞接合和有性生殖所必需的，而matA-2和matA-3能提高有性生殖能力但并不是有性生殖所必需的。第37页/共69页mata和matA的作用可能与酿酒酵母中的接合型基因类似，编码调节蛋白，对接合信息素的分泌和受体的产生进行调控。其它丝状子囊菌如Gibberella、Podospora、Pyrenoperiza、P.anserina等都有与粗糙脉孢菌类似的结构，即mata含有单一ORF而matA含有3个ORF，其作用可能也类似。但担子菌的接合型基因的结构和作用则不同于子囊菌。在担子菌中，接合型基因直接编码信息素和受体，直接控制着细胞的融合和有性孢子的形成。

图第38页/共69页第五节丝状真菌的转化及其特点一、外源DNA导入丝状真菌受体的方法外源DNA导入丝状真菌中最普遍使用的方法是CaCl2/PEG介导的原生质体转化。首先是用溶壁酶处理菌丝体或萌发的孢子获得原生质体，然后将原生质体、外源DNA混合于一定浓度的CaCl2、PEG(聚乙二醇)缓冲液中进行融合转化，然后将原生质体涂布于再生培养基中选择转化子。对于难以获得原生质体的丝状真菌来说，也可利用醋酸锂介导的完整细胞的转化，但转化率低。在丝状真菌中也应用了电转化技术，与普遍采用的CaCl2/PEG方法相比，虽然简化了操作步骤，但对提高转化率并无明显作用。基因枪注射(或生物导弹)转化技术，最近几年也在丝状真菌中得到应用，它同样不能十分有效地提高转化率。第39页/共69页二、载体及其选择标记1.载体转化DNA进入寄主细胞后，可独立寄主细胞核染色体而自主复制，或整合到寄主染色体上而随寄主染色体一起复制，前者被称为复制型转化，后者被称为整合型转化。已实现转化的丝状真菌中，绝大多数都是整合型转化。早期应用的载体通常以细菌质粒如pBR322、pUC等为主，在钙离子和PEG作用下向受体菌原生质体进行转移，转化效率较低，一般每微克转化DNA产生100个以下的转化子。这类载体引起的转化一般属于整合型转化，常常载体携带的真菌基因和载体本身会同时整合到受体染色体上。DNA进入受体细胞后，是通过同源重组和非同源重组两种方式而整合到受体菌的染色体上的。第40页/共69页

在丝状真菌中，转化DNA的整合不需要广泛的序列同源性，这是丝状真菌转化不同于酵母菌转化的普遍特点。同源重组产生两种类型转化子，一种在染色体基因组上带有目的基因的连锁的重复，这是载体与受体染色体DNA发生单交换第41页/共69页结果；另一种是基因取代，这是载体DNA与受体DNA间的双交换。非同源重组产生多拷贝整合的转化子,即在转化子DNA上带有目的基因的非连锁的重复。在黑曲霉(A.niger)转化中非同源重组倾向尤为显著，经常发生多拷贝质粒的串联整合。质粒的非同源整合实际上是发生在短的DNA序列间的同源重组。对一些转化子中质粒DNA和基因组DNA的连接部位的了序列分析表明，只有3～7个碱基序列的同源性。复制型转化需要构建含第42页/共69页复制型转化需要构建含有真菌复制子的复制型载体，已从玉米瘤黑粉、构巢曲霉、米曲霉、脉胞霉菌等多种丝状真菌的线粒体DNA或基因组DNA中分离到自主复制序列(ARS)。最初人们做了大量工作试图在体外构建构巢曲霉和粗糙脉胞霉的自主复制载体，但没有检测到具有自主复制活性。直到1988年Tsukuda等将玉米瘤黑粉菌的ARS插入到整合型载体中才成功地构建了复制型载体，它能在瘤黑粉细胞中自主复制,并使转化率高达10,000个/μgDNA；1991年Davis成功地构建了构巢曲霉自主复制型载体ARp1(11.5kb)。另外，还构建了许多自主复制载体，使一些丝状真菌实现了自主复制质粒的转化。第43页/共69页2.选择标记所用的选择标记分两类，一类是营养互补标记，另一类是显性标记(抗生素或药物抗性)。最初转化的丝状真菌多是利用营养缺陷型菌株而进行的，通过将野生型等位基因转移到相应的营养缺陷型菌株中，在基本培养基中筛选原养型生长菌落而得到转化子。目前,已用于丝状真菌转化的野生型标记基因有ade(腺嘌呤)、met(蛋氨酸)、pyr(嘧啶)、trp(色氨酸)、nic(尼克酸)、ribo(核黄素)、arg(精氨酸)、leu(亮氨酸)、pro(脯氨酸)、niaD(硝酸还原酶)等。使用营养互补标记基因的优点是有可能引导载体质粒整合到染色体的同源部位，且转化的本底低，易于筛选；缺点是在大多数丝状真菌中难以获得适宜的营养缺陷型菌株。显性标记基因避免了上述缺点而被广泛应用，它包括药物抗性标记如潮霉素B抗性、卡那霉素抗性和苯菌灵抗性等，还包括提供受体新功能的标记，其中构巢曲霉的amdS基因就能使受体在以乙酰胺或丙酰胺为唯一碳源或氮源的培养基上生长。细菌来源的抗性基因在丝状真菌启动子的带动下的表达可作为丝状真菌转化的选择标记，如lacZ

基因和GUS基因。第44页/共69页三、丝状真菌转化子的表达及其稳定性克隆基因在转化受体菌中的表达水平与多种因素有关，包括载体中所用启动子及其其它调控序列的存在、目的基因整合位置、整入拷贝数和受体菌株等。一般来说，无论整合型转化子还是复制型转化子，其在有丝分裂过程中是稳定的，大多数转化DNA在经过几十代的有丝分裂后仍保持稳定性。但经过减数分裂表现出高度的不稳定，尤其是粗糙脉孢菌。经过有性过程导致转化DNA丢失的机制有:质粒的丢失、DNA的切离、DNA重排等。第45页/共69页第六节丝状真菌中的质粒质粒最初是在细菌中发现的，后来在真核生物中也发现质粒。真核生物中记载最多的是真菌中含有质粒，少数植物含有质粒，动物细胞内没有质粒。真菌细胞中的质粒一般是环状或线状的双链DNA分子，而且大多是不编码任何表型性状的隐蔽质粒，位于细胞核或线粒体内。一、丝状真菌中的天然质粒及其分布到目前为止，已经发现很丝状真菌中都具有质粒，丝状真菌中的质粒有环状和线状两种类型，位于真菌的线粒体内(表2-3)。第46页/共69页

表2-3含有质粒的真菌名称Absidiaglauca灰色梨头霉Agaricusspp.

伞菌Ascobolusimmerses

埋生粪盘菌Ascosphaeriaapis蜂状囊菌Alternariaalternata链格孢菌Clavicepspurpurea

麦角菌Cochliobolus

旋孢腔菌Epichloetyphina香柱菌Erisyphegraminis

禾白粉菌Fusariumsolani茄腐皮镰刀菌Fusariumoxysporum

尖孢镰刀菌Leptosphaeriamaculans十字花科子囊腔菌Morchellaconica尖顶羊肚菌第47页/共69页Nectriahaematococca

赤球丛赤壳菌Neurosporacrassa

粗糙脉孢菌Neurosporaintermedia中脉孢菌Podosporaanserine四孢壳孢菌Phythiumspp.腐霉菌Rhizoctoniasolani立枯丝核菌Tilletiaspp.腥黑粉菌Tricodermaviride绿木霉

第48页/共69页有些丝状真菌中质粒的命名最早是根据质粒寄主的采集地点而定的。如粗糙脉孢霉菌中的Mauriceville质粒，中脉孢菌中的Lebelle和Fiji质粒等。对脉孢霉属的质粒概况研究表明，该属含有11种不同的质粒，质粒具有线状和环状两种类型(见表2-4)。对尖胞镰刀菌、立枯丝核菌的研究表明，每种真菌中都含有一种或一种以上的质粒。值得注意的是，在研究最多的曲霉中尚还没有发现质粒。

表2-4脉胞霉菌中的质粒同源组质粒类型同源组环状Mauriceville，Fiji，LaBelle，Java，MBI，VS，Harbin-2线状Kalilo，Maranhar，Moorea，Zhisi

第49页/共69页二、质粒的表型和质粒结构实际上，对所有丝状真菌中的质粒而言，其对寄主表型的影响仍然不清楚。在大多数情况下，没有发现对寄主真菌的生长有明显的影响作用。也许质粒能够赋予寄主选择优势，如在线粒体代谢或分裂的某些方面。另外，有些质粒与宿主真菌的老化有关。上面例举的具有质粒的真菌很多都是寄生真菌。真菌中的天然质粒最常见的是线状，环状质粒主要存在于在脉胞霉菌中，其它个别种如：旋孢腔菌、麦角菌和灰绿梨头霉中也有环状质粒。据DNA的双向电泳和脉冲电泳，可将线性质粒与线粒体DNA区分开。大多数线型质粒在两条DNA链的5’末端各有一个共价结合的蛋白，保护DNA免受酶的降解。在真菌中，环状质粒的检测比较复杂，常用探针检测线粒体部分，根据带型来进行确定。第50页/共69页1.线型质粒研究最深入的是脉孢霉菌中的天然质粒，对环状质粒和线状质粒都进行了全序列分析研究，特征见图。线状质粒Kalilo和Maranhar的总体结构是目前发现的大多数其它丝状真菌中线状质粒的典型代表。其特点如下：(1)有末端反向重复序列(TIR)，其长度因每种质粒而异；(2)在质粒的两个5’末端各有一个结合蛋白，保护质粒不受核酸外切酶的破坏；(3)有两个非重叠的ORF，每个ORF都起始于末端反向重复序列内，但转录方向相反，即转录方向都是从末端指向中央。其中一个ORF编码DNA聚合酶，另一个编码RNA聚合酶，它们与噬菌体和酵母线粒体中的多聚酶具有相似性。在两个ORF之间有基因间隔区，虽然含有转录信号，但尚未发现有什么功能。大多数真菌的线状质粒有两个类似的ORF，但有些只有一个ORF。不同的质粒，其ORF的排列可能也不同。第51页/共69页第52页/共69页立枯丝核菌中的3个线状质粒在几方面表现出非典型性，首先它们的末端似乎是闭合的发夹结构，其次是ORF都不大于91个氨基酸。

第53页/共69页2.环状质粒脉孢菌属中的环状质粒也不具有抗性特征。Fiji和LaBelle这两种环状质粒编码DNA聚合酶；Mauriceville和Varkud这两种环状质粒编码反转录酶(reversetranscriptase)。脉孢菌属中的环状质粒都产生全长的RNA转录物,特别是在Mauriceville和Varkud质粒中。VS质粒只存在于含有Varkud质粒的真菌菌株中，自己本身没有编码蛋白质的ORF，可能依赖于Varkud质粒提供的功能，但确在体内发现VS的转录物。第54页/共69页三、质粒的遗传一般线粒体质粒的遗传与线粒体和线粒体DNA(mtDNA)有相同的遗传方式。在有性杂交中，母本的质粒绝大多数或全部地传递给子代，一个例外是四孢壳孢菌AL2菌株中的pAL2-1质粒，当AL2在杂交中作为母本时，有些后代不含质粒。实验室内的研究表明,在种内和种间存在着水平转移。粗糙脉孢霉菌中的Kalilo和Maranhar质粒能通过异核现象在菌株间进行水平转移。另外，中脉孢霉菌和粗糙脉孢霉菌混合培养时，前者的Kalilo质粒能够进入粗糙脉孢霉菌不含质粒的菌株中，一定是通过部分或瞬间异核体。在麦角菌中，天然质粒通过原生质融合能从一个菌株转移到另一个菌株中。研究也发现Kalilo质粒存在于脉孢菌和Gelasinosporaspecies中，可能是种间转移的结果，也可能是来自相同的祖先。第55页/共69页四、质粒整合到mtDNA

中脉孢霉菌的Kalilo质粒和粗糙脉孢霉菌中的Mauriceville质粒能整合到线粒体DNA上，引起寄主菌株的衰老和死亡。大多数野生型菌株并衰老，而是在长的生长管中继续生长。衰老表型是一种反常现象，表明质粒的存在与菌株的衰老呈正相关，质粒的转移也引起衰老表型在菌株间的转移，最终在寄主死亡之前或死亡之时，几乎所有衰老菌株的mtDNA分子都是整合型，但游离的质粒也存在于培养物中。DNA的致死作用还不清楚,但有证据表明，质粒的过度复制使线粒体蛋白的合成受到抑制，则引起宿主菌的衰老。质粒Mauriceville和Kalilo插入方式与以前在真核或原核生物中观察到的插入方式完全不同。其机理还有待深入研究。第56页/共69页五、质粒的复制

1.环状质粒的复制脉孢菌环状质粒的复制一直是较有兴趣的研究课题。最新研究表明，Mauriceville编码的反转录酶，与质粒的复制有关。2.线状质粒的复制许多丝状真菌中的线型质粒，都具有末端重复序列TIR和共价结合蛋白TP(表)。

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表丝状真菌中具有TIR和TP的线型质粒

质粒来源大小TIRTP

pA12Ascobolusimmerses5.6kb≈700bp有

pMC32Morchellacortica6kb≈750bp不详

pCF637Ceratocystisfimbriata8.2kb不详有

pFQ501Ceratocystisfimbriata6kb750bp不详

pRS64立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)2.6kb不详不详

pEMAgaricusbitorquis7.3≈1kb不详

pMPJAgaricusbitorquis3.6不详不详

kalDNA中脉孢菌(Neurosporaintermedia)

9kb1361bp有

第58页/共69页pFOXC1尖胞镰刀菌(Fusariumoxysporum)pFOXC2尖胞镰刀菌(Fusariumoxysporum)1.9kb50bp