实验二碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

实验二碱性磷酸酶的提取及其比活性测定第一页，共三十四页，2022年，8月28日材料选择细胞的破碎分离纯化鉴定第二页，共三十四页，2022年，8月28日

碱性磷酸酶(ALP,AKP)

Alkalinephosphatase第三页，共三十四页，2022年，8月28日一、实验目的1、掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。第四页，共三十四页，2022年，8月28日二、实验原理1、AKP概述

①催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用②最适pH：8.6～10.3③

特点：特异性低第五页，共三十四页，2022年，8月28日④体内位置：细胞膜表面-肾小管的筛状缘-肠粘膜的微绒毛-胆小管的细胞膜缘-肝窦状腺表面-胎盘合体细胞滋养层细胞外表面第六页，共三十四页，2022年，8月28日⑤正常血清：ALP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性的一半。⑥临床意义：血清ALP活力增高常见于

-肝胆疾病（胆道阻塞等）

-骨骼疾病（佝偻病等）

-甲状腺功能亢进

-妊娠和生长期儿童第七页，共三十四页，2022年，8月28日2、AKP的分离、提取、及纯化整个制备过程可分为5个阶段：①材料的选择和预处理，②细胞的破碎，③提取，④纯化（包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳等），⑤浓缩、干燥及保存。第八页，共三十四页，2022年，8月28日①取材取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织本次实验：肝脏第九页，共三十四页，2022年，8月28日②生物组织与细胞的破碎机械破碎法：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵渗透破碎法：低渗条件使细胞溶胀而破碎反复冻融法：超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎酶法：如用溶菌酶破坏微生物细胞

第十页，共三十四页，2022年，8月28日③选择合适分离提取方法把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉把酶从溶液中提取出来第十一页，共三十四页，2022年，8月28日有机溶剂方法——

有机溶剂分段沉淀法原理：利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。第十二页，共三十四页，2022年，8月28日有机溶剂：①正丁醇能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中②乙醇30%AKP溶解状态60%AKP沉淀状态③丙酮33%AKP溶解状态50%AKP沉淀状态通过离心，去除部分杂蛋白通过离心，进一步去除杂蛋白第十三页，共三十四页，2022年，8月28日④保护酶活性措施低温条件下操作所有试管均需洗干净选择合适的pH及合适的缓冲体系，以稳定酶活性Mg(Ac)2~NaAc混合液提取AKPpH8.8Tris缓冲液测AKP活性保护和稳定AKP第十四页，共三十四页，2022年，8月28日

2g新鲜兔肝剪碎→匀浆管

加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液2ml，匀浆

匀浆液入离心管

用4ml上述混合液冲洗匀浆器，并倒入离心管，混匀，记体积VA

A液A1管A2管剩余A液0.1mlA液+0.1mlA液+4.9ml0.01MpH8.8Tris4.9ml生理盐水

三、操作步骤（待测酶活性）（待测蛋白质含量）加2ml正丁醇，搅拌3-5'，室温放置30'，过滤，入离心管第十五页，共三十四页，2022年，8月28日

上述滤液

加等体积冷丙酮，混匀，

离心2000rpm、5分钟上清入回收瓶沉淀

加4.0ml0.5MMg(Ac)2,搅拌，记体积VB

B液0.10mlB液

+4.9ml0.01MpH8.8Tris

B1管B2管

剩余B液VB'0.1mlB液+4.9ml生理盐水

加

0.45VB'

冷乙醇96%→30%，混匀，

离心2500rpm,5分钟

（待测酶活性）（待测蛋白质含量）第十六页，共三十四页，2022年，8月28日上清

弃沉淀入离心管

，记体积VB‘’，加

0.83

VB‘’冷乙醇

96%（30%→

60%）混匀，

离心

2500rpm,5分钟

上清入回收瓶

沉淀加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液4ml，搅拌，记体积Vc

C液C1管C2管

剩余C液Vc'

0.10mlC

液

+

1.9ml0.01MpH8.8Tris

0.1mlC液+0.4ml生理盐水

加0.5Vc'冷丙酮→33%，混匀,离心2000rpm,5分钟

（待测酶活性）（待测蛋白质含量）上述离心结果第十七页，共三十四页，2022年，8月28日上清

弃沉淀上清入回收瓶沉淀加5ml0.01MpH8.8Tris，搅拌，记体积VD

D液D1管

D2管

0.10mlD

液

+

0.9ml0.01MpH8.8Tris

入离心管

，记体积Vc'',加1/3Vc''冷丙酮→

50%，混匀，

离心2000rpm,5分钟

剩余D液（待测酶活性）（直接待测蛋白质含量）上述离心结果第十八页，共三十四页，2022年，8月28日比活性：指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位

比活性=酶活性单位数/mg蛋白二、实验原理

3、建立测定酶比活性的方法

①②第十九页，共三十四页，2022年，8月28日磷酸苯二钠法原理：磷酸苯二钠AKP苯酚K3Fe(CN)64-氨基-安替比林醌类化合物λ=510nm①测定酶活性

第二十页，共三十四页，2022年，8月28日AKP活性单位定义:37℃,反应15分钟,产生1ug苯酚

一个AKP活性单位（u）第二十一页，共三十四页，2022年，8月28日试剂(ml)B1234A1稀释液0.10B1稀释液0.10C1稀释液0.10D1稀释液0.10pH8.8Tris缓冲液0.10复合基质液33333

立即混匀。将各管置于37℃水浴精确保温15分钟0.5%K3Fe(CN)622222

立即混匀。终止酶促反应，室温静置10分钟。H2O调零，

λ=510nm比色，记录各管OD。第二十二页，共三十四页，2022年，8月28日计算酶活性：各制剂总AKP单位数（U）=查表所得值×稀释倍数×总体积注：A1、B1、C1、D液分别稀释50、50、20、10倍（标准曲线）第二十三页，共三十四页，2022年，8月28日

考马斯亮蓝法

（CoomassieBrilliantBlueG-250，Bradford法）

考马斯亮蓝G-250——红色和蓝色

酸性游离状态棕红色465nm+蛋白质蛋白质-染料复合物595nm②测定蛋白质含量第二十四页，共三十四页，2022年，8月28日试剂(ml)B1234生理盐水0.10A2稀释液0.10B2稀释液0.10C2稀释液0.10溶液D0.10考马斯亮兰试剂55555

混匀。2分钟后，H2O调零，λ=595nm比色，记录各管OD。第二十五页，共三十四页，2022年，8月28日计算蛋白质含量：各制剂总蛋白含量（mg）=查表所得值×稀释倍数×总体积注：A2、B2、C2液分别稀释50、50、5

倍第二十六页，共三十四页，2022年，8月28日③各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算1、AKP比活性：AKP比活性（U/mg）=每ml制剂中AKP活性单位数（U）每ml制剂中蛋白质含量（mg）第二十七页，共三十四页，2022年，8月28日2、得率得率=每一制剂中总的酶活性单位溶液A中总的酶活性单位×100%第二十八页，共三十四页，2022年，8月28日3、纯化倍数纯化倍数=每一制剂AKP比活性（U/mg）溶液A制剂AKP比活性（U/mg）第二十九页，共三十四页，2022年，8月28日匀浆A液第一次丙酮提取（B液）第二次乙醇提取（C液）第三次丙酮提取（D液）总体积（ml）蛋白含量（mg/ml）总蛋白量（mg）AKP活性单位（u/ml）总AKP活性单位（u）比活性（u/mg）纯化倍数得率AKP分离纯化小结表：第三十页，共三十四页，2022年，8月28日有机溶剂体积的计算——96%乙醇VB/中加乙醇96%30%（VB/+VX）×30%=96%×VXVX

=

0.45VB/VB//中加乙醇（96%）从30%60%（VB//+VX）×60%-

VB//×30%

=96%×VXVX

=5/6（0.83）VB//第三十一页，共三十四页，2022年，8月28日注意事项低温条件进行有机溶剂边加边搅拌加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀加有机溶剂的量计算精确乙醇上层液入回收瓶第三十二页，共三十四页，2022年，8月28日比色分析的原理有色溶液设：T

(透光度)A=lg=