实验蔗糖酶的提取

实验蔗糖酶的提取第一页，共二十五页，2022年，8月28日杨劲树生命科学学院416室电话：88206155E-mail:公邮： (课件/通知，密码biochem3yang)第二页，共二十五页，2022年，8月28日实验内容安排1、蔗糖酶的提取2、离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶3、蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法4、蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法5、蔗糖酶分离纯化产物的SDS－PAGE检测分析及蛋白质相对分子质量测定6、质粒DNA的微量制备及电泳检测7、氨基移换反应及其产物的鉴定第三页，共二十五页，2022年，8月28日实验所涉及的技术破碎技术离心技术层析技术光谱分析技术电泳技术发光分析技术生物大分子制备技术第四页，共二十五页，2022年，8月28日实验报告写作要求1、实验目的和要求2、实验内容和原理3、实验材料和主要仪器4、实验方法和步骤5、实验数据记录和处理6、实验结果和分析7、实验讨论和心得*每人准备一本实验记录本，做好实验预习、实验过程和实验原始数据的记录。请保存好，实验结束后上交，作为实验报告成绩的一部分！第五页，共二十五页，2022年，8月28日实验成绩1、实验报告成绩（纸质版）70％2、实验平时成绩30％(1)到课情况（签到、迟到、早退和请假）(2)实验操作，器材、仪器使用(3)值日情况(4)实验预习、实验过程和实验记录（实验记录本）第六页，共二十五页，2022年，8月28日《学生实验管理办法》

为了把学生逐渐培养成在实验室中做实验的良好习惯；同时，为了更好地保证学生实验的正常进行，本实验室特制定以下管理办法。请在实验室做实验的同学严格按以下要求做，并请实验教师和实验技术人员协助管理。第七页，共二十五页，2022年，8月28日一.实验器材使用1．学生实验时一般每人配备一套玻璃器具。实验前应根据“玻璃器具清单”清点器具是否齐全，有无缺损，如有缺损请及时向老师报告、登记并补足，缺损器具由上一实验班的同学负责。2．在实验过程中，应小心使用玻璃器具，如有破损请及时报告老师，登记后补上，破损器具由本人负责，并按规定处理。3．实验结束后，应把使用过的玻璃器具清洗干净，并放回自己的玻璃器具箱柜中锁好，如有缺损及时登记补足，损失由本人负责。4．对公用实验器材，使用时要爱护和珍惜。如有损坏，则由损坏者负责赔偿。第八页，共二十五页，2022年，8月28日二．实验仪器使用1．学生实验使用仪器前，应在教师讲解了使用方法后，或在已学会如何使用的情况下，方可自己单独操作有关仪器；如违反操作规程，将仪器损坏，应由当事人按规定处理。2．仪器如果以小组为单位共同使用，某一同学如出现不当操作损坏仪器，则以小组为单位共同赔偿损失。3．如因教师没有讲解好仪器的使用方法等原因造成学生损坏仪器，应由教师负全责，并按规定处理。4．仪器使用结束后，请使用人及时在仪器登记本上记录仪器使用情况，如仪器使用有问题应马上向教师报告。第九页，共二十五页，2022年，8月28日三．实验安全与习惯1．在实验中使用有毒、有害、腐蚀性和挥发刺激性试剂时，一定要谨慎操作，做好防护措施，如戴手套，在通风柜中使用等。2．实验时如不慎将有毒、有害、腐蚀性试剂洒在实验桌或地上，应及时处理好桌面及地面，以免影响自身和他人的安全。3．对于使用过有毒、有害、腐蚀性试剂的实验器材，应及时清洗处理，不要影响后面的实验安全。4．如在实验中使用易燃易爆试剂、带有细菌的物品和放射性同位素，应严格按安全规定操作。5．使用实验仪器时，应注意用电安全；实验仪器使用结束后，应及时关闭电源。6．严禁在实验室吸烟。7．禁止在实验室用电炉或明火取暖。8．实验时，应保持桌面的整洁不乱；实验结束后，应将自己的桌面收拾干净方可离开实验室。第十页，共二十五页，2022年，8月28日9．在每次实验结束后，安排卫生值日的同学应自觉地完成以下工作：⑴收理实验用试剂、器材和仪器。⑵将实验桌上的废液缸中的废物倒掉洗净，并把桌面擦干净。⑶把使用过的仪器及仪器桌面擦拭干净。⑷把实验室的地面扫清拖净。⑸将实验室产生的实验废物和垃圾倒掉。对于不能做好值日工作的同学，下次实验后应补做。第十一页，共二十五页，2022年，8月28日四．其他１．上实验课请不要迟到早退，如有事请向任课老师事先请假或事后说明。２．在实验室里上课时不要玩电脑游戏。３．进入实验室要衣着整洁，要求穿实验服做实验，不能穿拖鞋进实验室做实验。实验过程中不要随便串走，保持安静，不要喧哗。４．请不要在实验室里吃零食或用膳。第十二页，共二十五页，2022年，8月28日生物实验教学中心网址第十三页，共二十五页，2022年，8月28日实验一

蔗糖酶的提取第十四页，共二十五页，2022年，8月28日实验目的和要求

学习掌握蔗糖酶的提取、分离纯化的基本原理和方法。第十五页，共二十五页，2022年，8月28日细胞破碎的常用方法机械法非机械法液体剪切法固体剪切法超声波法、机械搅拌法、高压匀浆法压力和研磨物理法、化学渗透法、酶溶法实验基本原理1、酵母细胞破碎

本实验采用研磨的方法。通过固体剪切法（研磨）将酵母细胞破碎，把蔗糖酶从酵母细胞中提取出来。第十六页，共二十五页，2022年，8月28日2、蔗糖酶的初步分离纯化蛋白酶常用的初步分离纯化方法有：盐析、选择性变性、有机溶剂沉淀等。本实验采用选择性变性（加热）、有机溶剂（乙醇）沉淀等方法对蔗糖酶进行初步的提纯。由于酶蛋白在分离纯化过程中易变性失活，为了能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终保持酶的活性，如在低温下操作等，这样才能收到较好地分离提纯效果。第十七页，共二十五页，2022年，8月28日实验材料与试剂1、实验材料：市售干酵母粉2、实验试剂：⑴石英砂⑵95%乙醇(-20℃）⑶20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液第十八页，共二十五页，2022年，8月28日实验器材与仪器1、电子天平（称量样品）2、研砵（每组一套）3、50ml高速离心管（4支/组、离心管架1个/组）4、托盘天平（离心管平衡用）5、高速冷冻离心机6、恒温水浴箱（50℃）7、制冰机8、1.5ml离心管（留样品Ⅰ、Ⅱ用）及离心管架9、－20℃冰箱第十九页，共二十五页，2022年，8月28日实验操作方法和步骤

分组操作：每组3～4人1、酵母细胞破碎称取市售干酵母粉10g，约3g石英砂放入研钵中直接研磨至尽可能成细粉末状（约15分钟），量取总体积50ml的20mmol/LTris-HClpH7.3缓冲液，分2次加在研砵内研磨10分钟，使呈糊状液体；将糊状液体转移到2支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃、12000r/min离心15分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I）,另留1ml上清液（样品I）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS分析。第二十页，共二十五页，2022年，8月28日2、热处理将上一步抽提液（样品I），迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却5分钟，转移至两支50ml离心管中，平衡后，4℃，15000r/min离心15分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），另留1ml上清液（样品Ⅱ）放置－20℃冰箱保存，用于蔗糖酶蛋白含量测定、测定蔗糖酶活力和SDS分析。第二十一页，共二十五页，2022年，8月28日3、有机溶剂（乙醇）沉淀：上清液（样品Ⅱ）加入相同体积的－20℃的95%乙醇，冰浴中温和搅动混匀，至少放置30分钟，然后转移至两支50ml离心管中，两支离心管平衡后，4℃，12000r/min离心10分钟，弃去上清液，沉淀放置－20℃冰箱保存，以备用于下周实验。第二十二页，共二十五页，2022年，8月28日实验步骤研磨破碎，离心，转上清（体积），留样品Ⅰ（1.5ml离心管）50℃热处理转冰浴，离心，转上清（体积），留样品Ⅱ（1.5ml离心管）95%乙醇冰浴沉淀，离心，弃上清，留沉淀（原50ml离心管）第二十三页，