分子生物学实验教学教案

河南科技大学实验教学教案课称分物指师

李市场河南科技大学

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实验一

大肠杆菌受态细胞的备及转化实验名称

实一大肠菌受细的备转

实验学时

4每次实验组数

6

每组人数5

实验类型

综合性实验目的和要求：通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。器：控

温摇床(37℃)，高速冷冻离心机，水浴锅，冰箱（℃,‐70℃）超净工作台，培养箱(37℃)，752分光光度计，灭菌锅等。：细菌处于容易吸收外源状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的形成抗的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间促使在转化过中获得的新的表（如r等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择培养基上。：将质粒载体转移进受体细菌诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源。将已经转化的细胞在选择培养基上进行筛选。告：要实。：①无菌操作②温操作

实验目实验原

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。将质粒载体转移进受体细菌诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation)是将外DNA分子引入受体细胞使之获得新的遗传性状的一种手它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代为了提高转化效率实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好通过监测培养液的来控制α菌株的为时细胞密度在个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度:cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量所用的试剂,如等均需是最高纯度的或AR.),用超纯水配制,好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞并用CaCl2处理使其处于感受态,然后与pUC19质粒共保温,实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因)，可通Amp性来筛选转化子。如受体细胞没有转，则在含Amp培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。一.仪器

控温摇床(37)水浴锅

高速冷冻离心机冰（℃,‐℃）

二.试剂

超净工作台752分光光度计胰蛋白胨

培养箱(℃)灭菌锅无菌水,酵母粉Amp三.其他用品移液器，离心管平皿量筒琼脂酒精灯酒精棉球

枪头三角瓶200ml试剂瓶烧杯甘油三角玻棒火柴［溶液配制］0.1mol/L溶液配置灭菌LB液体培养基氨苄青霉素（无菌水配制50_60mg/mL溶液，抽虑灭菌置－20冰箱中保存。四.材料

E.coli.DH5质粒五:实验步骤：(CaCl2)（20人一班，分三组）第一天从大肠杆菌DH5板上挑取一个单菌落接于mLLB液培养基的试管中,℃振荡培过夜。第二天：1.取mL菌液转接到一个含有mLLB液体培养基锥形瓶中，℃

22振荡培养2－3h此时OD≤0.4-0.5细胞数务必≤10／mL。此为实验成功的关键)3.将菌液转移到mL离心管中，冰上放置10min。4.离心10min4000r/min）回收细胞。4℃5.倒出培养液，将管倒置便培养液流尽。6.用冰冷的mol/LCaClmL浮沉淀，立即放在冰上min。27.0－4℃r/min,离心min，回收细胞。8.用冰冷的0.1mol/LCaCl2mL浮细胞必放在冰上29.分装细胞，每μL一份。此细胞为感受态细胞。转化：10.取200μL新鲜制备的感受态细胞加入DNA（50ng混匀冰上放置30。同时作两个对照管受体菌对照：μL受态细胞＋μL无菌水质粒对照：μLmol/LCaCl溶液＋μL质粒溶液11将管放到℃循环水浴1212.冰浴min。13.每管加800μLLB液体培养基，℃培养（慢摇14.将适当体积（μL）已转化的感受态细胞，涂在含有氨苄青霉素的培养皿中。15.倒置平皿℃培养12－16h出现菌落。16.计算转化效率关于大杆菌感受态胞的制及转化讲解

1、感受细胞的概念重组分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源片段并实现其转化的一种生理状态它是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄外界环境因子的影响可以使感受态水平提高一万倍而也可大大促进转化的作用细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时加入占总体积的无菌甘油或-℃保存（有效期6月2、转化概念及原理在基因克隆技术中转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl等化学试剂法）处理后，2使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl法法最先是由于1972发2现的。其原理是细菌处于0，CaCl的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化2混合物中的DNA形成抗的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理促使细胞吸收DNA复合物在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值被转化的细菌中重组子中基因得到表达在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

671077671077处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×10~2×转化子/质粒，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它二价金属离子（如100~1000倍。

、DMSO还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使进细菌，转化率最高能达到

9

~10

转化子/ug环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。3、感受细胞制备及转化中的影响因素⑴、细胞的生长状态和密度最好从-℃或-℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存4℃的培养菌液。细胞生长密度每毫升培养液中的细胞数在510个左右为佳即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD控制。菌株OD为5，细胞密度5600×10个/ml左右注意OD值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同600密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。⑵、质粒的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降般地DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

⑶、试剂的质量所用的CaCl等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4。⑷、防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、酶或杂所污染否则均会影响转化效率或杂DNA转入。⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

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实验二质粒的提取其酶切

实验学时

4每次实验组数

6

每组人数5

实验类型

验证实验目的和要求：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。器：微量移液器，微量离心管，常用玻璃器皿，恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒与线性染色体在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～这个狭窄的范围内，线性的双螺旋结构解开而被变性管在这样的条件下共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂两条互补链彼此相互缠绕会紧密地结合在一起加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体的两条互补链彼此已完全分开复性就不会那木迅速而准确它们缠绕形成网状结构过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－复合物等一起沉淀下来而被除去。：用碱裂解法提取质粒告：实个。：1、时格2。

实二质DNA的提取及酶实验目

通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。实验原

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒

与线性染色体在拓扑学上的差异来分离它们pH值介于12.0这个狭窄的范围内，线性的双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂两条互补链彼此相互缠绕会紧密地结合在一起。当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时价闭合环状的质粒的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开性就不会那木迅速而准确们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体与不稳定的大分子RNA蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。实验仪：量移液器，微量离心管，常用玻璃器皿，台式高速离心机，分光光度计，恒温培养箱，恒温摇床，台式离心机，高压灭菌锅。试剂及液：(1)用碱法提取质粒DNA溶液（缓冲液葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.o用前加溶菌酶4rngmL。溶液2变性液0．2rnoI/I，1％SDS溶液3乙酸钾溶液ml5L11.5ml,冰醋酸，H。（2）缓冲液EcoR酶解缓冲液（l0）TBE冲（I×取108g,硼酸55g,／L,EDTApH8.o40ml，用H2o定容到l000压灭菌作为l0贮液稀释倍后作为工作液使用。TE缓冲液10／L，IL，其中含有RNase20µg／。（3）上样液及其他试剂

上样液（6溴酚蓝质量浓度40％蔗糖水溶液。溴化乙啶染色液（／m水中溶解0.2g溴化乙啶，混匀后4℃避光保存。异丙醇，70乙醇等。实验步（一）提取粒1.将2ml含相应抗生素的液体培养基加入试管中入上述的含质粒的大肠杆菌单菌落，℃振荡培养过夜。2.取培养物倒入微量离心管中，4000r/min心2min。3.弃上清，吸尽残液，使细胞沉淀尽可能干燥。4.加入100ul溶液Ⅰ，充分混匀，室温放10min。200ul溶液Ⅱ（新鲜配制盖紧管盖，轻轻颠倒数次混匀，将离心管放冰上。5.加入150ul溶液Ⅲ（冰上预冷紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。6.12000r/min,离心min，将上清转至另一离心管中。7.加入等体积酚：氯仿（1：1蛋白复混匀，12000，离心5min，将上清转移到另一离心管中。8.加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置～10min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。9.用1ml70%乙醇洗涤质粒沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。10.加50ul缓冲液，其中含有ug/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。（二）酶切

取DNA溶液加酶切缓冲液Eco

RI酶1ul无菌水补至总体积ul37℃保温3h,加终止液，准备下个实验电泳，分析质粒的限制性酶切图谱。质粒提取的关键问题即质粒提取中三种溶液的作用：碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；溶液III3M醋酸钾/2M醋酸。让我们先来看溶液I的作用任何生物化学反应首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了那么50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部因此如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响所以说溶液中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTACa2+

和Mg

2+

等二价金属离子的螯合剂配在分子生物学试剂中的主要作用是抑制DNase的活性和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工只要是在不太长的时间里完成质粒抽提就不用怕DNA会迅速被降解因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆（不妨可以自己试一下自然就难高效率抽提

得到质粒如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒因为SDS也是碱性的只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀这是由于没有正确理解一些书上的有关变性复性的描述所导致有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂第二必须温柔混（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组的断裂会带来麻烦。每个人都知道溶液加入后就会有大量的沉淀但大部分人却不明白这沉淀的本质最容易产生的误解是当SDS碰到酸性后发生的沉淀如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液中不加SDS怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在％的SDS溶液中慢慢加入5N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（dodecylsulfate遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS，而PDS是水不溶的因此发生了沉淀如此看来溶液III入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS高浓度的盐得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合平均两个氨基酸上结合一个分子钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了长的DNA自然容易被给共沉淀了管SDS并不与DNA子结合。那么2M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和，因为长时间的碱性条件会打断DNA所以要中和之基因组一旦发生断裂只要是－100kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且

不得激烈振荡不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组混入琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带很多人误认为是溶液加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物与它是不是沉淀下来其实没有关系溶液III入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。不要以为PDS沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了实还有很多蛋白质不能被沉淀因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为混入的而发生降解。这里用5/24/1的酚/氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重碰到高浓度的盐溶（比如4M的异硫氰酸胍，离心后酚相会跑到上层不利于含质粒的水相的回收但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行于异戊醇的添加其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰也方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐因此只要加入2倍体积的乙醇在室温放置几分钟后离心就可以将质粒DNA沉淀出来这时候如果放到－20℃时间一长反而会导致大量盐的沉淀这点不同于普通的酒精沉淀回收所以不要过分小心了高浓度的盐会水合大量的水分子因此分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用70的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上并用tip将沉淀打碎就能得到好的样品得到的质粒样品一般用含RNase（50ug/ml）的TE缓冲液进行溶解，不然大量未降解的RNA会干扰电泳结果的.

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实验三琼脂凝胶泳技术［实验的］通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技。实验名称每次实验组数

6

实三琼糖胶泳术每组人数5

实验学时实验类型

4验证实验目的和要求：通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测的方法和技术。器：，琼胶，台，高锅，紫投。：分在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应分在高于等电点的溶中带负电荷电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链几具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分的迁移速度取决于分子筛效应，即分本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的片泳动速度不一样，可进行分离分的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。胶电泳不仅可以分离不同对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,构型不同的DNA分子。如上次实验提取的pUC19质，有3种型：超螺旋的共价闭合环状质粒closed，称开环质粒即价闭合环状质粒条断裂circularDNA,简称）线状质粒，共价闭环状质粒DNA2条发生断裂linearDNA，简称LDNA3种型的质粒分在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒泳动最快，其次为线状，环质粒。：术酶粒DNA.告：星实。：1、注糖2戴。

［实验原理］分子在琼脂糖凝中泳动时有电荷效应和分子筛效应。分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样进行分离DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系.。凝胶电泳不仅可以分不同相对分子质量的DNA,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的DNA分子上次实验提取的pUC19质粒，有种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒closedcircular简称CCCDNA)开环质粒DNA即共价闭合环状质粒链断裂，（opencircular简称线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2链发生断裂DNA，简称L3构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3带，超螺旋质粒DNA动最快，其次为线状DNA，开环质粒DNA。[仪器、材料与试剂]一、仪器1.恒温培养箱2.琼脂糖凝胶电泳系统3.台式离心机4.高压灭菌锅5.紫外线透射仪二、材料1.三羟甲基氨基甲烷(Tris)2.硼酸3.乙二胺四乙酸(EDTA)4.溴酚蓝5.蔗糖6.琼脂糖7.溴化乙锭

8.DNA实验步骤一)制备琼脂糖凝胶电泳槽及用胶量：称取琼脂糖，放入锥形瓶中，加30ml0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化取出摇匀，则为1%的琼脂糖凝胶液。冷却至60,加入适量EB,混匀。（二）胶板的制备1.取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙2.将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。梳子调整齐3.将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡4.待胶凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，将胶槽放在电泳槽内。5.加入电泳缓冲液至电泳槽中。（三加样,用移液器将已加入上样缓冲液的DNA样品加入样品（录点样顺序及点样量（四）电泳1.接通电泳槽与电泳仪的电源注意正负极片段从负极向正极移动DNA的迁移速度与电压成比，最高电压不超过V/cm。2.当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作问题讨论1）在细胞质粒DNA是共价闭环（covalentlycircularDNA，cccDNA以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处缺刻，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环（circular，ocDNA两条链在同一处或其附近断裂，则变成性DNA分子。在电泳时，同一质粒的电泳速度因的构型不同而异，其次序为：cccDNA＞直线DNA＞ocDNA，因此在本次实验中琼脂糖胶电泳上的自制质粒呈现3带。如果你不小心在溶液II（实验二）加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7－10带，这是由于特殊的序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不同）所致。2琼脂糖是一种从海藻中提取出来的线状高聚物当熔化再凝固后就会形成固体基质其密度取决于溶液中所含琼脂糖的量带负电荷的核酸就可以在这种基质中于电场的作用下向阳极移动核酸在琼脂糖基质中的迁移率取决于下列参数：①DNA的子大小；②琼脂糖的浓度；DNA的构象④所加电压；⑤电场方向；⑥碱基组成与温度；⑦嵌入的染料；⑧电泳缓冲液的组成等。琼脂糖浓度对核酸迁移率的影响是：一定大小的DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率不同在一定浓度的琼脂糖凝胶能够分辨的核酸片段大小范围内核酸片段的迁移率与其相对分子质量大小相反。3）溴化乙的化学名称是，－二氨基r－乙基－一苯基锭溴盐（3，－diamino－5－ethyl－－phenyl－，简称或EB或EtBr于溴化乙锭分子插入，在紫外光的照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带呈现出桔黄色的荧光检测EB能插人分子中的碱基对之间，完成与DNA结合（超螺旋与EB结合能力小于双链闭环，而双链闭环DNA与合能力小于线状双链DNA所吸收的260nm的紫外光（UV）传递给，或者结合的EB本身在3O0nm和360nm吸

收的射线均在可见光谱的红橙区，590nm波长发射出来EB染色具有以下特点：①操作简便快速，室温下染色；②不会使核酸断裂；③灵敏度高10ng或更少的可检出；④可以加到样品中，随时用紫外吸收追踪检查。但应该特别注意的是，溴化乙啶是诱变剂，配制和使用时应戴乳胶（或一次性塑料手套并且不要将该染色液洒在桌面或地面上凡是沾污溴化乙啶的器皿或物品，必须经特殊处理后，再进行清洗或弃去。河南科技学

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实验名称

实验四物基因组的取

实验学时

4每次实验组数

6

每组人数5

实验类型

验证实验目的和要求：通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。器：，式机，，光，灌。：利用液氮对植物组织进行研磨从而破