抗癫痫药物的层析法测定

第三十章

层析法测定生化物质第2页第三节

治疗药物测定一、TDM的方法学概述药物的检测接受临床化学的常用技术。体液中的药物为微量，其检测不仅受结构相像的内源性物质干扰，还易受和原型药仅有微小差别的代谢物干扰。而一些药物除原型药外，还需同时测定具药理活性的代谢物，对检测方法有较高要求。因此,常规的检测方法不能满足药物检测的灵敏度与特异性的要求。目前常用的体液中药物浓度测定法有层析法、免疫化学方法等。第3页第3页

1.层析法包括定量薄层法、气相色谱法及高效液相色谱法等，其共同的特点是分别度好、专属性强，可以同时测定几种药物。薄层色谱法虽然不断改进点样定量技术并用扫描定量，但其灵敏度和重复性仍差，除用于毒物的定性检测外，在TDM中极少应用。高效液相色谱法应用最广，美国的药典规定大部分药物的标准检测法为高效液相色谱法，并常用作评估其他方法的参考方法。第4页

1.层析法近年还发展了HPLC-质谱联用(HPLC-tandemmassspectrometers,LC-MS)，更进一步提高了特异性和灵敏性，分别性能好,在检测药物的代谢物有其独特的优点。兴奋剂的检测，则要求必需用HPLC-MC法。本法缺点是仪器昂贵,技术要求高，测定费时，其专用性强，一台仪器在同一时间内只能测定一种或一类药物,须要相当长时间的训练,需困难的样本预处理,限制了其推广普及。第5页第5页2.免疫化学方法不少药物都是半抗原或抗原，可制备药物相应的特异性抗体，用免疫化学方法对其进行检测。免疫化学方法灵敏度高，可达ng甚至pg水平，可满足全部药物TDM的要求。免疫化学方法包括放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫等方法，其优点是灵敏度高，取样少，操作简洁，样本不须要进行预处理。放射免疫法同位素污染，需有防护设备，由于衰变和辐射自分解导致标记物有效运用时间缩短，该法极少接受。第6页2.免疫化学方法酶免疫法，成本低，测定快速,几特殊钟多至几小时能完成一个样品测定,但灵敏度较差,极少药物接受此法测定。化学发光技术、荧光偏振免疫法、微粒体发光技术、电化学发光、时间辨别荧光免疫分析法等方法的灵敏度、精密度和精确性均佳，检测周期短,自动化程度高,操作简便,适用于急诊和大量样本的测定，发达国家试验室通常接受此法，国内应用也渐增多。第7页（1）光谱分析法包括可见光－紫外分光光度法（UV）、荧光分光光度法、火焰放射光谱法和原子吸取光谱法等。分光光度法由于其专一性差,简洁受血液中其他组分的干扰,在测定前必需进行粗分别、抽取、浓缩,即使这样,单独用于测定血药浓度时常常受到灵敏度的限制，操作繁琐。如与层析法结合运用,可以大大提高其专一性,不易受其他药物或内源性物质的干扰。火焰放射光谱法和原子吸取光谱法则为锂等金属离子药物测定的常用方法。第7页3.其他技术第8页（2）毛细管电泳技术接受高电场强度的电泳方式,具有微量、高效、灵敏度高、操作简洁、速度快、自动化，不须要溶剂，仅用缓冲液，但仪器昂贵等特点。（3）抑菌试验曾用于抗菌药物浓度测定,但由于其仅为分级式半定量,并且影响因素多,特异性、灵敏度、重复性都差。第8页3.其他技术第9页1．气相色谱法样品经过去除蛋白后，再用有机溶剂提取其待测药物，使溶剂挥发，用确定量溶剂将残渣重溶后即可在确定条件下进样分析。当样品进入气化室后，在确定温度下样品内各组分被瞬间气化，并由载气（流淌相）带入分别柱，在分别柱的固定相和流淌相之间进行支配，最终因支配系数不同而被相互分别。待各组分先后进入监测室后便产生相应的信号，由记录仪记录各组分的色谱峰。依据出峰时间（保留时间）和峰面积即可计算出样品中所含药物的浓度。目前，气相色谱法是丙戊酸的主要检测方法。第9页二、抗癫痫药物的层析法测定第10页第10页二、抗癫痫药物的层析法测定2．高效液相层析法一般接受反相高效液相色柱分别和紫外检测器(或其他检测器)检测。首先须要用适当的溶剂（如甲醇）除去样品中的蛋白并提取其中的药物。当化学结构不同的物质通过层析分析柱时，因其理化性质的差异而在柱上保留时间不同，极性强的物质在反相C18柱上的保留时间短，出峰快；极性弱的物质则相反。因此，经层析柱可把苯巴比妥、苯妥因钠及卡马西平分别，依据其各自的峰高，从校正曲线方程求出其浓度。本法可同时监测几种抗癫痫药物。第11页1．气相层析法由于分析是在气态下进行的，故对那些熔点高、挥发性差、对热不稳定或极性大的药物此法不太适合，例如苯妥英钠、扑痫酮及苯巴比妥的血药浓度测定。如与质谱联用可进一步提高其检出实力和精确度。第11页三、层析法测定抗癫痫药的方法性能评价第12页三、层析法测定抗癫痫药的方法性能评价2．高效液相层析法HPLC可与质谱联用，快速地对药物进行定性、定量分析。此法的优势是可以同时完成多个项目的分析