分子实验报告酶切

DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定试验原理重组质粒的构建需要对DNADNA连接酶的觉察与应用，为重组质粒的构建供给了有力的工具。限制性核酸内切酶酶切分别法适于从简洁基因组中分别目的基因。质粒和病毒等DNA分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简洁。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA连接酶：T4DNA连接酶。T4DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式〔以T4种：〔一〕、具互补粘性末端片段之间的连接

DNA连接酶为例〕主要有以下几大多数的核酸内切限制酶都能够依据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生一样的粘性末端，连接后〔同尾酶〕切割时，虽然可以有效地进展连接，但是获得的重组DNA分子消逝了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重切割下来。〔二〕、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不肯定总能产生出互补的粘性末端。实际上有很多情况都是例外的，由于有些限制酶切割DNA分子之后所形成的都是平末端的片段；有的试验要用两种不同的限制酶分别切割载体分子和外源DNA，形成的也多半是非互补的粘性末端DNA片段，PCR扩增的和化学合成的DNA片段或由RNA为模板反转录合成的cDNA片段，也不会具有互补的粘性末端。理论上任何一对DNA平末端均能在T4

DNA连接酶催化下进展连接，这给不同DNA分子的连接带来了便利。但是，平末端连接更为简单，且速度也慢得多，由于一个平末端的5’磷酸基团或3’羟基与另一个平末端的3’羟基和5’磷酸基团同时相遇的时机显著削减，通常平末端的连接速度为粘性末端的1/10~1/100。为了提高其反响活性，一般选择16℃较为适宜。外源目的基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，重组DNA分子必需导入适原核细胞，到真核细胞，进一步到构造简单的高等动、植物细胞都可以作为基因工程的受体细胞。选择适宜的受体细胞已成为重组基因高效克隆或表达的根本前提之一。所谓受体细胞〔receptorcell〕又称为宿主细胞或寄主细胞〔hostcell〕等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的上讲是有应用价值和理论争论价值的细胞。明显，并不是全部的细胞都可用作受体细胞。一般状况下，受体细胞的选择应符合以下根本原则：〔1〕便于重组DNA分子的导入；〔2〕能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；〔3〕便于重组体的筛选；〔4〕遗传稳定性高，易于扩大培育或发酵生长；〔5〕安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；〔6〕选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞，利于外源基因蛋白表达产物在胞内的积存，或促进外源基因的高效分泌表达；〔7〕受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性；〔8〕具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；〔9〕在理论争论和生产实践上有较高的应用价值。以上是受体细胞选择的总原则，在实际应用过程中，可依据具体需要或用途而重点考虑其中局部要求即可。原核生物细胞:是较为抱负的受体细胞类型，其缘由是：1〔1〕大局部原核生物细胞没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA进入；〔2〕没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与暴露的染色体DNA重组削减了麻烦；〔3〕基因组简洁，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进展遗传分析；〔4〕原核生物多数为单细胞生物，简洁获得全都性的试验材料，并且培育简洁，生殖快速，试验周期短，重复试验快。鉴于上述缘由，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌等。大肠杆菌是迄今为止争论得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程争论和应用中进展最为完善和成熟的载体受体系统。体外连接的DNA重组分子导入适宜的受体细胞才能大量地进展复制、增殖和表达，将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化〔或转染〕、转导、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。本试验以大肠杆菌为受体的基因转移。转化方法：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化〔transformation〕。细菌转化的本质是受体菌直接吸取来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下根本步骤：〔1〕细菌感受态的形成；〔2〕转化因子的吸取；〔3〕整合复合物前体的形成；〔4〕单链DNA转化因子的整合；〔5〕转化子的形成。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，其细胞外表的构造和组成均与革兰氏阳性细菌有所不同，自然条件下很难进展转化，其主要缘由是转化因子的吸取较为困难，尤其是那些与其亲缘关系较远的DNA分子更是如此。因此在大肠杆菌的重组质粒DNA分子的转化试验中，很其中代表方法之一是Ca2诱导的大肠杆菌转化法。Ca2诱导的转化：细菌处于简洁吸取外源DNA状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过化学方法，人工诱导细菌细胞进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细菌内。其原理是将处于对数生长2期的细菌置于0℃，CaCL2

低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，同时Ca2

使细胞膜磷脂层形成工诱导的感受态。此时参加DNA，Ca2又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶〔Dnase〕的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外外表上。经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶构造发生猛烈扰动，随之消灭很多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Ca2处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得105～106个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。转化子的筛选以及鉴定：在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，并非全部的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除局部含有我们所期盼的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期盼重组DNA然后进一步检测到含有期盼重组DNA分子的克隆子将直接关系到基因克隆和表达的效果，也是基因克隆和工程操作中极为重要的环节。通常我们将导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子，而含有重组DNA组子。2在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了肯定的选择性遗传标记基因，组子的初步筛选。一般的做法是将转化处理后的菌液〔包括比照处理〕适量涂布在选择培育基上，在最适生长温度条件下培育肯定时间，观看菌落生长状况，即可选择出转化子。选择培育基是依据宿主细胞类型配置的培育基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培育基，在LB培育基中参加适量的某种选择物，即为选择培育基。选择物是由载体DNA分子等，相应的筛选〔选择〕方法包括抗药性筛选、插入失活筛选和显色互补筛选等。在本试验中利用的是麦康凯培育基，用来筛选重组子。质粒PUC19进入E.coliDH5α后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培育基的平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培育基中的乳糖产生有机酸，PHPUCβ-半乳糖苷酶活性而消灭白色菌落，这样依据这个条件即可筛选重组子。试验材料以及仪器PUC19的质粒、LB培育基、麦康凯培育基提取质粒试剂盒恒温振荡培育箱，高速离心机，旋涡振荡器，水浴锅，酒精灯，微波炉，天平，电子天平，分析天平，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪尖，Eppendorf管，塑料薄膜，微量移液器，手套，记号笔。LB培育基，抗生素氨苄青霉素(50ug/L)，TAE电泳缓冲液(10×)，琼脂糖，50×TAE缓冲液，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNAMarkerk／HindⅢ试验步骤预备阶段培育基的制备LB培育基 麦康凯培育基枪尖的预备 1000ul、200ul、20ul的枪尖在枪尖盒内装好，贴上标签EP管的预备 在三角瓶内装好，不要装得太满预备好之后集体灭菌，备用试验阶段酶切Puc19的质粒DNA酶切体系：8.7ulddHO、4ulPUC19质粒DNA、1.5ul102×Buffer、0.8ulHindⅢ。按上述的挨次将酶切体系加好，混匀，置于37℃的水浴锅内2h。制备感受态细胞〔无菌条件〕将事先已经培育好的OD值为0.5左右的大肠杆菌的菌悬液置于冰上，备用；取出三个EP管，在酒精灯上将菌悬液加到三个管中，每管1.5ml；之后再离心，5000rmp×5min,离心之后将上清液倒掉〔在酒精灯下〕之后再在每管中参加1.5ml的菌悬液，离心，倒掉上清液；参加800ul的CaCl5min；2离心5000rmp×5min，倒掉上清；参加100ul的CaCl-4℃2麦康凯培育〔无菌条件〕将已经灭好菌的液体麦康凯培育基放置在室温下；在大约培育基的温度与手背的温度差不多时，参加ul的氨苄青霉素〔先预热再将氨苄青霉素打入培育基中〕；倒平板，大约每个平板20ml；连接连接体系：9ul的ddHO、3ul的digestedPUC19DNA、5ul的digestedλ噬菌23体的DNA、2ul的10×Buffer、1ul的T连接酶。4依据上述挨次依次参加，混匀，16℃的水浴锅，连接过夜。转化在三管感受态细胞中分别参加5ul连接液、0.5ul的puc19质粒、空白；混合均匀，42℃热击90s〔时间要准确计时〕；之后置于冰上，再在每管中参加600ul的颖的LB培育基；摇床震荡培育1h。涂布依据以下的表格中显示的涂平板〔无菌条件〕不含Amp的平板1个〔+++〕不含Amp的平板1个〔+++〕含量类型20ul50ul100ul200ul含有连接〔Amp〕含puc19质(Amp)液粒1个〔+〕2个〔++〕1个〔-〕2个〔+++〕1个〔+++++〕空白(Amp)1个〔-〕涂布验证表格〔“+”表示红色菌落的多少，“—”表示没有红色菌落〕涂布观看观看平板上菌落的生长状况：记录状况如上，其中不含Amp的平板上培育基变黄；在含有Amp的平板上涂有连接液的平板上可以看到白色的菌落，这就是我们划线培育；用牙签轻轻挑去白色菌在含有氨苄青霉素的麦康凯培育基上划线，尽量将平板合理利用，不要将培育基划破；做好标记，连续培育。验证用接种环挑取平板上单独的大的白色菌落在液体培育基中〔菌落的选择肯定要适当，这对于后面的验证很重要〕；挑取两管菌液，做好标记，37℃振荡培育过夜；用试剂盒提取质粒：在各加1.5ml菌液离心〔两管菌液不要混用，可以看做两种质粒〕；250参加25微升溶液Ⅱ，恳求那个翻转倒置数次，直到获得透亮的裂解液；参加350微升的溶液Ⅲ，马上翻转倒置数次至有絮状沉生成；×1min，弃收集管中的液体；在离心柱中加500微升的BufferHB，离心10000rmp×1min，弃收集管中的收集液；在离心柱中参加700微升的WashBuffer，离心10000rmp×1min，弃收集管中的收集液；空离心柱再离心13000rmp×2min；4将离心柱取出置于1.5ml的EP40微升的ElutionBuffer,将液体加在离心柱的孔中，静置2min,之后离心13000rmp×1min;将离心柱取出，将EP管中的质粒DNA放好，做好标记；重组质粒DNA的酶切重组质粒DNA的酶切体系：4.5ul的ddHO，4ul的重组质粒DNA，21.0ul的Buffer，0.5ul的HindⅢ；37℃的水浴锅内1h;电泳在所得的酶切液中参加3微升的LoatingBuffer,混合均匀点在胶孔中，点上相应的HindⅢ的marker；在EB中染色10min左右在紫外灯下观看试验现象，分析条带；留意事项限制性核酸内切酶的酶切反响应属于微量操作技术，无论是DNA样品还是酶的用量都很少，必需严格留意吸样量的准确性并确保样品和酶全部参加反响体系。留意酶切加样的次序，一般先加重蒸水，其次加缓冲液和DNA，最终加酶。前几步要把样品加到管底的侧壁上，加完后用力将其甩到管底，而酶液要在参加前从-20℃冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液时洗头应从外表吸取，防止由于插入过深而使吸头外壁沾染过多的酶液，取出的酶液应马上参加反响混合也得液面以下，并充分混匀。酶液使用完毕后马上放回冰箱，防止酶的失活。留意盖紧Eppendorf管的盖子，防止水浴加热的过程中水汽进入管内，并留意做好标标记以防样品混淆。为了提高连接效率，一般实行提高DNA的浓度，增加重组子比例。这样就会消灭DNA自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其5’末端的磷酸基，防止环化，通过接