实验十三螺旋体检验

试验十三-试验十三-螺旋体检验(1稿)1/9试验十三螺旋体检测一、临床意义1、螺旋体(Spirochaeta5Borreli，又名疏螺旋体属，密螺旋体属Treponem，钩端螺旋体属CristispirSpirochaet钩端螺旋体病的致病菌，后二属不致病。梅毒螺旋体〔TreponemaPallidun〕是人类梅毒的病原体，主要经性接触直接传染，也产、早产或患先天性梅毒。〔，其中一类是特异性制动抗体，为lgM，当有补体存在和厌氧条件下，对活螺旋体的动力有抑制作用，并可将螺旋体杀死或溶解，对机体的再感染有保护作用；另一类是反响素，为lgA与lgM的混合物，可与正常生物组织中的类脂抗原发生非特异性结合，对人体无保护作用。除梅毒螺旋体感染，检测结果应结合临床综合分析。用活的或死的梅毒螺旋体或其他成分作为抗原检查抗梅毒螺旋体抗体这种方法敏感性及特异性都高，用于证明试验，尤其适用晚期梅毒。但血和脑脊液行RPR试验均为阴性者，由于这类方法检测的是抗梅毒螺旋体IgG抗体即使患者已经经过充分的治疗IgG抗体仍保持阳性，所以不能用以观看疗效、复发及再感染。①荧光密螺旋体抗体吸取试验(FTA-ABS试验)：用间接免疫荧光法检查血清中抗梅毒螺旋体抗体 ②梅毒螺旋体抗体微量血凝试(MHA-TP用梅毒螺旋体提取物致敏的红细胞微量血凝分析法检查相应的抗梅毒螺旋体抗体其滴度在1∶80以上则可判定为抗体阳性此试验的特异性与敏感性均高而且方法比FTA-ABS试验简便故应用广泛 ③梅毒螺旋体制动试验(TPI)：活的梅毒螺旋体参加患者血清在补体参与下梅毒螺旋体活动可受到抑制临床上主要承受RPRTPHA两种方法检测，RPRTPHA这主要是由于RPR阳性.同时，RPR的敏感性和特异性有肯定的局限性，且肉眼推断易受检验者主观因素的影响。而TPHA检测特异性强，灵敏度高，并可实现自动化、标准化，适应大量标本的检测。梅毒是由梅毒螺旋体引起的慢性感染性疾病较低，但由于其病程长，危害性大，早期检出具有肯定的意义。获得性梅毒分三期：第一期〔初期〕梅毒，下疳分泌物中有大量螺旋体，传染性极强；其次期梅毒，梅毒疹及淋巴结中有大量螺旋体；第三期〔晚期〕梅毒，病灶中螺旋体数量很少。梅毒螺旋体在体外不易培育抗体进展试验室检测旋体抗原试验〔初筛试验〕和梅毒螺旋体抗原试验〔确证试验〕等，不同的感染阶段应选用不同的检测方法。2、钩端螺旋体病是由钩端螺旋体所致的一种自然疫源性疾病。钩端螺旋体在自然界广泛存在，尤其是在降雨量多的热带国家，它可在淡水、潮湿的土壤、植物和淤泥存活很久，可感染人类、野生动物和家畜〔尤其是啮齿目动物。动物受感染后，大多无病症而呈带菌状态，但钩体可以在肾中长期存在并生殖，从尿中排菌，污染水源、食物和土壤。人类假设接触被钩体污染的水源、食物、土壤，钩体可经皮肤破损处、黏膜外表〔譬如眼睛或鼻子〕进传播。疾病埋伏期是疾病埋伏期是2天到4个星期。病情可持续几天到3个星期或更久。征状包括发高烧、严峻头痛、冷颤、肌肉苦痛和呕吐，亦可能消灭黄疸(眼球和皮肤呈黄色)、红眼、肚痛、腹泻或出疹。假设病人不及早承受治理，可能会消灭肾脏损伤、脑膜炎、肝脏功能衰竭和呼吸困难；有些罕见的例子更会导致死亡。二、螺旋体的检验程序〔一〕梅毒螺旋体检验程序渗出液、皮疹、淋巴结或组织穿刺液等直接镜检 镀银染色检查 血清学检查暗视野检查13-1梅毒螺旋体检验程序〔二〕钩端螺旋体检验程序血液、尿液、脑脊液等直接镜检 分别培育 动物接种〔豚鼠〕 血清学检查观看发病状况暗视野检查 镀银染色检查 抽心血 显微镜凝集试验等暗视野检查图13-2钩端螺旋体检验程序三、试验目的要求〔题前空二格，五号宋体加粗〕生疏梅毒螺旋体、钩端螺旋体的形态特征、暗视野及其染色检查方法。把握梅毒螺旋体的血清学筛选和证明试验的原理、方法、临床意义。生疏钩端螺旋体的培育特性、分别培育方法。了解钩端螺旋体显微镜凝集试验原理、方法、结果判定。四、器材与试剂〔题前空二格，五号宋体加粗〕培育基：柯氏〔Korthof〕100～400μg/ml5-氟尿嘧啶〔5-Fu〕的柯氏培育基等。RPRFTA-ABSELISA等。冯泰那〔fantana〕镀银染色液，负染色液(2%刚果红、1%盐酸酒精)。生理盐水、暗视野显微镜等。暗视野显微镜、试管、吸管、滴管、载玻片、盖玻片、生理盐水、火柴、酒精灯、接种环、记号笔、吸水纸、擦镜纸、二甲苯、香柏油等。血清型的钩瑞螺旋体液体培育物。五、步骤与方法〔题前空二格，五号宋体加粗〔标题层次详见编写须知〕〔一〕采集标本：1用于直接镜检。2、疑似钩体患者血，尿标本；发病10日内取血液，2周后取尿液，有脑膜刺激病症者取脑脊液。3、采集病人静脉血液，分别血清进展血清学诊断〔二〕染色及形态观看螺旋体瘦长、松软、弯曲呈螺旋状的运动活泼的单细胞原核生物。全长3～500微米，胞壁，内含脂多糖和胞壁酸，以二分裂方式生殖，无定型核〔属原核型细胞，对抗生素敏感；与原虫的相像之处有：体态松软，胞壁与胞膜之间绕有弹性轴丝能活泼运动，易被胆汁或胆盐溶解。在分类学上由于更接近于细菌而归属在细菌的范畴。用暗视野显微镜观看含活菌的颖标本，可看到运动活泼的螺旋体。运动有三种类型：化能异养；好氧、兼性厌氧或厌氧；自由生活、共栖或寄生。1、梅毒螺旋体形态观看：原理：依据梅毒螺旋体的生物学根本特征。梅毒螺旋体〔TreponemaPallidun〕是梅毒的病原体，因其透亮，不易着色，故又称苍白螺旋体。梅毒螺旋体瘦长，5～15×0.1～0.2um，形似细密的弹簧，螺旋弯曲规章，平均8～14个，两端尖直。电镜下显示梅毒螺旋体构造简单，从外向内分为：外膜〔主要由蛋白质、糖及类脂组成〔主要由蛋白质组成〔；30未经染色的梅毒螺旋体在一般光学显微镜下不易看清视野显微镜下，黑暗的视野上可看到具有螺旋状及特征性运动方式发光的螺旋体。方法取渗出液涂片后直接于暗视野显微镜下观看，或实行初期及二期梅毒硬性下疳、梅毒疹的渗出物等用暗视野或墨汁显影，如查见有运动活泼的密螺旋体即可诊断；或镀银染色镜检。①暗视野显微镜观看法1〕1滴，用无菌盐水棉球擦净病变部位，用钝刀刮破病损处外表组织〔避开出血，再用棉球擦干挤压四周组织使组织液渗出，用毛细管吸取下疳的渗出液，将组织渗出液与玻片上无菌盐水混合，加盖玻片后镜检。取自皮疹、淋巴结或组织穿刺液等也可用于检查，但阳性率较低。翻开暗视野显微镜，在聚光器上加一滴蒸馏水〔湿式。将玻片置于载物台上。上升聚光器使蒸馏水接触玻片的底部，先用低倍镜调焦，再用高倍物镜观看。1涂片；待涂片枯燥后滴加固定液，固定1分钟后，用水冲洗；滴加媒染剂，加热至有蒸汽出现，作用0.5分钟，水洗；加硝酸银染液，微加温，染色约0.5分钟，水洗，待干镜检。〔负染色法2之混匀，涂布成均匀厚片，待干，以1%盐酸酒精洗涤，待其自然干后镜检。结果判定〔旋转运动、伸身移行、弯曲前行〕为阳性结果。直接镜检适用于初期梅毒的检查，如见形态特征典型，有特别运动方式的密螺旋体，结合临床病症及病史，可初步报告〔疑为梅毒螺旋体。直接涂片镜检可见梅毒螺旋体移行、屈伸、翻滚等运动方式。镀银染色可见背景呈淡黄褐色，梅毒螺旋体呈棕褐色，菌体小而纤细，中间略粗，两端8～14直硬、两端尖直，螺旋较细密而规章。经刚果红染色法，螺旋体无色，背景为蓝色。螺旋体13-1。2、钩端螺旋体形态观看：〔1〕原理：依据钩端螺旋体的生物学根本特征。渡银染色的钩端螺旋体镜下背景呈淡SC运动活泼，呈现翻转、滚动等运动特征。〔2〕方法①钩端螺旋体暗视野显微镜观看取钩钩端螺旋体培育物制成压滴标本。在暗视野聚光器上滴加镜油，将标本片置载物台上，上升聚光器使镜油与标本片严密接触。先用低倍镜对光，至能清楚观看到标本中的物体为止。然后在标本上滴加镜油。用油镜观看。②钩端螺旋体fantana镀银染色检查取清洁玻片一张，加钩端螺旋体培育物一滴。待涂片自然枯燥后滴加固定液，固定1min，用无水乙醇冲洗。滴加媒染剂，加温至有蒸汽冒出，作用30s，水洗。加硝酸银染液，微加温，染色约30s，水洗，待干镜检。〔刚果红法检查取20%螺旋体培育物与之混匀，涂布成均匀厚片，待干，以1%盐酸酒精洗涤冲洗至蓝色，待其自然干后镜检。〔3〕结果观看①镀银染色结果的形态特征：镜下背景为淡黄褐色，钩端螺旋体呈棕褐色或棕黑色，一端或两端呈钩状弯曲，呈SC形，细密的螺旋看不清楚。端弯曲成钩状，有时菌体屈曲呈“S或C”等字型，以长轴为中心，做盘旋运动，或以波浪式朝直端方向前进。③负染色法〔刚果红法〕结果油镜下钩端螺旋体无色，背景蓝色。表13-1 螺旋体显微镜下形态冯泰纳镀银染色 吉姆萨染色 暗视野显微镜观看钩端螺旋体梅毒螺旋体回归热螺旋体

镜下背景为淡黄褐色至棕黑色，菌体为棕褐色，一端或两端呈钩状弯曲，珍宝点状连接成SC旋不太清楚，表体整齐，粗细均匀与钩端螺旋体呈色相像。其特征为小而纤细，两端尖直，8～12。

螺旋体为紫红色或红4～8个稀疏而不规章弯曲。

取钩端螺旋体培育物制成压滴标本，在黑暗的背景上可见钩体闪耀发光，一端或两端弯曲成钩状，运动活泼，消灭翻转、滚动等运动。〔三〕分别培育1981年，Fieldsteel等承受棉尾兔单层上皮细胞，在微氧条件下培育成功，在人工培育基上尚不能培育。梅毒螺旋体一般不进展培育，钩端螺旋体分别培育方法如下：血液标本的培育采集可疑钩端螺旋体病人发病第一周内的静脉血液2～3ml，取0.25～0.5ml5ml的柯氏〔Korthof〕液体培育基中，血液量与培育液的1:10～1：20〔2～5的尿样〔无菌尿或中段尿，马上接种或者经低温离心14000r/min离心30mi〕5-Fu〔培育基中的5-Fu。2～3281～2(4)3～57～14〔7～10天为生殖顶峰。端螺旋体生长，可进一步进展鉴定；假设培育四周无钩体生长，则为阴性。〔四〕血清学检验1、梅毒螺旋体的血清学诊断原理梅素螺旋体有三类抗原成份。一是螺旋体外表特异性抗原：刺激机体产生成的复合抗原：当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可粘附在螺旋体上，形成复合抗原，此〔Aegagi〔康氏试验〔华氏试验。其中，第一类是特异性抗体〔抗TP抗体，后两类为抗类脂质的非特异性抗体。方法〔RP〔从牛心肌中提取的心磷脂、胆固醇和卵磷脂组成的RPR抗原，与梅毒螺旋体有共同抗原，可与患者血清中的反响素结合，消灭凝集现象〔当血清在RPR卡片的圆圈中混合，如消灭碳粒凝集说明是阳性血清。半定量检测，易于观看结果，适合于大量人群的血清筛选。但敏感性、特异性较差，有时会消灭生物学假阳性和假阴性反响RPRTRUST毒螺旋体抗体筛选试验。取待检血浆或血清、阳性掌握血清、阴性掌握血清各5l圆圈内，并使血清集中到整个圆圈内〔每张卡片应有10个或12个反响圈，1RPR旋动卡片8mi〔约100r/mi，马上观看结果。在RPR白色卡片上观看有无黑色凝集颗粒或絮片。无凝集为阴性结果〔阴性血清反响圈内不消灭黑色碳颗粒凝集，消灭明显黑色凝集颗粒或絮片为阳性〔阳性血清反响圈内可消灭明显黑色凝集碳颗粒或絮片。1:2～1:326按上述定性试验方法再做半定量试验，再记录消灭阳性〔+〕反响的最高血清稀释倍数，即抗体效价。②甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)：是将从牛心肌中提取的心磷脂、胆固醇、卵磷脂组成的性病争论室抗原重悬于含有特制的甲苯胺红溶液制成应素结合，消灭肉眼可见的凝集块。该试验为筛选试验。操作方法：按试剂盒说明书进展。取待检血清、阳性掌握血清、阴性掌握血清各50μl，参加试验卡的圆圈内，并集中到整个圈内。1旋转摇动8min，速度约lOOr/min，马上用肉眼观看结果。甲苯胺红不加热血清试验结果在试验卡上，阴性质控血清反响圈内不消灭红色清即可推断患者血清的试验结果。1:2～1:326法再做半定量试验。这两种试验〔RPR和TRUST〕是非螺旋体抗原试验。是用正常牛心肌的心类脂〔Cardiolipin〕〔UDRL〕热血清反响素试验US，其抗原是UDRL抗原的改进，敏感性和特异性与UDRL相像。反响1～2周就可测出，其次期阳性率几乎达100，第三期阳性率较低〔雅司、回归热、麻风、红斑狼疮、非典型肺炎、类风湿关节炎、肝硬化等亦可查出反响素，称梅毒果进展分析。集试验TPP、一种是荧光密螺旋体抗体吸取试验FT～AB常用于梅毒的早期诊断。③明胶颗粒凝集试验TPP：原理将梅毒螺旋体Nichols致敏的颗粒一旦与被检查样品中的抗梅毒抗体相遇时，即可产生肉眼可见的凝集颗粒〔particleagglutinationtest,PA法并且可用来测定抗体效价。方法按试剂盒说明书进展。定性试验只做4孔，半定量试验做10孔〔表13-21〕用微量加样器加标本稀释液至反响板。用微量加样器加待检血清至第1孔，混匀后进展倍比稀释。用试剂盒内专用滴管于第3孔加未致敏粒子254孔至最终一孔加致敏粒子25。将反响板置震荡器震荡30s，或用手轻轻拍打混匀。加盖后于室温(18～25℃)水安静置，2h～4h后观看结果。13-2TPPA孔号__ 12 3 4 5678910标本稀释液〔μl〕100252525252525252525待检血清〔μl〕2525252525252525252525标本稀释倍数1:51:101:201:401:801:1601:3201:6401:12801:2560未致敏粒子(μl)致敏粒子〔μl〕2525252525252525标本最终稀释度1:40l:801:1601:320l:6401:12801:25601:5120明胶颗粒凝集试验结果血清在1：80〔++～++++〕与未致敏颗粒〔3〕粒均不发生凝集反响者为阴性反响。-〔不凝集：明胶颗粒集中在孔中心，呈纽扣状，边缘光滑；±〔可疑：明胶颗粒浓集呈边缘光滑、圆整的小圆环：+〔凝集：明胶颗粒形成较大的环状凝集，外周边缘不光滑：～〔强凝集：明胶颗粒掩盖在整个孔底，呈多形性膜状，边缘粗糙。-～++++时的血清最高稀释倍数作为抗体效价。即为阴性。可疑：第三孔为阴性-FTA—ABS〔FTA-ABIgG镜下观看，假设有发荧光的螺旋体即为阳性。方法：Nichols〔20〕抗原悬液，在玻片上5mm〔醇〕固定。56℃30min50μl200μl〔Reiter株非致病性密螺旋体〕混匀，37℃作用30min，以充分吸除非特异性抗体。荧光染色吸附后的待检血清用PBS1:20～1:320清分别滴加于抗原片上，置于湿盒内37℃作用30min，然后将玻片在PBS液中浸洗，换液35min，吸水纸吸干。于各抗原反响片上滴加荧光素标记的羊抗人IgG盒内3℃作用30mi，再用PBS液洗片〔方法如前，待玻片干后用甘油缓冲液封片。菌体消灭；阳性比照可见多数〔高倍视野15条〕荧光菌体消灭。并以此为参照作出待检标本的判定。〔FTA-ABS〕参照阳性标准血清的荧光强度判定结果。每高倍镜视野假设半数〔10条左右〕消灭荧光，则为++；多于半数〔15条左右〕〔约20条〕“可疑”结果参照非特异性血清的荧光强度判定为++或+，阴性结果参照阴性比照血清判定为-或+。凡++～++++者，可确证为梅毒螺旋体感染。⑤酶联免疫吸附试验ELIS：承受双抗原夹心法。将高度纯化的TP抗原包被反响板TPTP高纯度TPTPTPTP当参加酶底物后，可呈现颜色反响。颜色深浅与血清中抗TP方法：分别取待测血清、阴性及阳性比照血清各50μl，加于反响板相应凹孔中；每孔再参加酶标记TP50μl37℃30min。取出反响板，弃尽孔中液体。用洗涤液洗板6次，拍干液体。100μl37℃15min50μl。用酶联仪于450nm波特长读取吸光度值A及待测血清的A结果酶联免疫吸附试验〔ELISA〕待测血清ACOACOCO=0.20+阴性比照平均A值。阴性比照A0.12，阳性比照A≥0.30；阴性比照＜0.030.03⑥梅毒螺旋体制运试验〔TPI〕：用来检测血清中是否存在抑制螺旋体活动的特异性抗体。用活梅毒螺旋体〔Nichol株〕加病人颖血清，35℃培育16作正常血清比照，然后用暗视野显微镜观看活动的螺旋体数目，如试验标本活动的螺旋体数目小于或等于比照血清标本内的40%，即为阳性。2、钩端螺旋体血清学检验原理：钩端螺旋体可与同型免疫血清结合产生凝集现象。当血清高倍稀释时，镜下可见钩体呈蜘蛛样凝集〔数根钩体的一端钩连在一起，另一端呈放射状散开；当血清作〔血清中的补体使凝集的菌体在数分钟内发生溶解又可用于测定病人血清中特异性抗体的效价。方法微孔板法显微镜凝集试验1〕1:501:1001:1501:2001:4001:8001～6100μl/7100μl生理盐水作为比照；所设稀释血清排数依标准株钩体型的数目而定。加抗原：于每排各孔内分别参加一种不同型别的钩体培育液，100μl/孔。混匀372h。1，覆以盖玻片，在暗视野显微镜下观看，以凝集状况与游离活动钩体的比例来判定结果。-：钩体正常分散存在，完全无凝集现象，与比照孔一样。+：25%左右的钩体凝集呈蜘蛛状，75%的钩体游离且运动活泼。++：50%左右的钩体凝集呈蜘蛛状，余50%的钩体游离且运动活泼。+++：75%左右的钩体凝集或被溶解，呈蜘蛛状、蝌蚪状或块状，其余钩体游离分散。++++：几乎全部钩体溶解成蜘蛛状或折光率较高的团块及点状，偶见极少活钩体游离。凝集效价在1:300待检菌的型别。显微镜凝集试验方法见表13-3表13-3 显微镜凝集试验方法1234567血清稀释度1﹕501﹕1001﹕1501﹕2001﹕4001﹕800比照〔μl〕100100100100100100—〔μl〕——————100〔μl〕100100100100100100100血清最终稀释度1﹕1001﹕2001﹕3001﹕4001﹕8001﹕1600—372h，暗视野显微镜观看结果假定结果 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ + -〔六〕留意事项与小结1、使用暗视野显微镜观看时，需留意：①载玻片和盖玻片应清净无污，载玻片宜薄，不超过1.2mm；②聚光器的高度应适当，以背景较暗物象清楚为好；③观看完毕后将集光器果；⑤应多取组织液提高阳性率，但要尽量避开出血；⑥取材后应马上观看，以免影响螺旋于初期梅毒的检查，因患者下疳分泌物中有大量螺旋体。2、RPRTRUST2～8℃保存，使用前恢复至室温；RPR梅毒感染，阳性结果需进一步做抗梅毒螺旋体抗体试验确认。3、FTA-ABS1次后，必需换液；每次试验均应同时设阳性、阴性及非特异性血清比照。4、ELISA