血红蛋白的提取与分离

血红蛋白的提取与分离第一页，共三十九页，2022年，8月28日

体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1.主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3.课题重点：凝胶色谱法的原理和方法

学习目标第二页，共三十九页，2022年，8月28日(一）蛋白质占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物。2.组成元素C、H、O、N1.含量3.相对分子质量高分子化合物氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别。4.蛋白质结构的多样性第三页，共三十九页，2022年，8月28日(二）蛋白质的提取1.分离生物大分子的基本思路：

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2.蛋白质分离和提取的原理：

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。第四页，共三十九页，2022年，8月28日人们用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。第五页，共三十九页，2022年，8月28日大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。（三）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶：

根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。1.概念：3.凝胶色谱法的原理—分子筛效应：①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。②依据的特性是：蛋白质分子量的大小。第六页，共三十九页，2022年，8月28日4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程第七页，共三十九页，2022年，8月28日第八页，共三十九页，2022年，8月28日在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。

能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。（四）缓冲溶液1.概念:2.作用:3.缓冲溶液的配制:4.在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:磷酸缓冲液第九页，共三十九页，2022年，8月28日（五）电泳1.概念带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。第十页，共三十九页，2022年，8月28日③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。第十一页，共三十九页，2022年，8月28日3.类型琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。4.实例由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。①应用②聚丙稀酰胺凝胶第十二页，共三十九页，2022年，8月28日蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。③原理④SDS作用为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS。第十三页，共三十九页，2022年，8月28日样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定（一）蛋白质提取和分离步骤第十四页，共三十九页，2022年，8月28日血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个a肽链两个β肽链四个亚铁红素基团①成分(1)血液组成第十五页，共三十九页，2022年，8月28日第十六页，共三十九页，2022年，8月28日每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。②组成及作用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。③选材第十七页，共三十九页，2022年，8月28日(1)红细胞的洗涤①洗涤红细胞目的除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。②洗涤操作A.采集血样B.低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果）（二）操作过程第十八页，共三十九页，2022年，8月28日采集得到哺乳动物的血第十九页，共三十九页，2022年，8月28日初次离心后的结果第二十页，共三十九页，2022年，8月28日3次洗涤后的结果第二十一页，共三十九页，2022年，8月28日C.吸取血浆：上层透明的黄色血浆；D.盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤；E.低速离心（低速短时间）；F.重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。第二十二页，共三十九页，2022年，8月28日(2)血红蛋白的释放加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。磁力搅拌器第二十三页，共三十九页，2022年，8月28日搅拌器转子第二十四页，共三十九页，2022年，8月28日搅拌器正在工作第二十五页，共三十九页，2022年，8月28日(3)分离血红蛋白溶液将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。第二十六页，共三十九页，2022年，8月28日甲苯层（无色透明）白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层（暗红色）试管中溶液层次第二十七页，共三十九页，2022年，8月28日用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体

分离：第二十八页，共三十九页，2022年，8月28日取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。(4)透析除去样品中分子量较小的杂质。①过程②透析目的第二十九页，共三十九页，2022年，8月28日第三十页，共三十九页，2022年，8月28日2.凝胶色谱操作（1）凝胶色谱柱的制作第三十一页，共三十九页，2022年，8月28日（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择A、材料“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克B、代表意义：交联葡聚糖凝胶（G-75）第三十二页，共三十九页，2022年，8月28日配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。②凝胶的前处理③凝胶色谱柱的装填方法A、固定B、装填将色谱柱处置固定在支架上将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。第三十三页，共三十九页，2022年，8月28日第三十四页，共三十九页，2022年，8月28日样品加入与洗脱正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。第三十五页，共三十九页，2022年，8月28日开始进行层析第三十六页，共三十九页，2022年，8月28日收集得到的纯化后的蛋白第三十七页，共三十九页，2022年，8月28日思考：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。1.在血红蛋白的整个过程中用磷酸缓冲液处理的目的是什么？2.与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这对你进行蛋白质得分离有什么意义？答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。第三十八页，共三十九页，2022年，8