细胞破碎与提取

细胞破碎与提取第一页，共八十七页，2022年，8月28日工业化应用：经济性（高收率，纯度次要）一般研究：80%-90%纯度结构研究：95%以上纯度医疗：全面分析2、研究目的：越到后面的纯化越困难，增加成本，延长操作时间，收率低考虑产品的质量、数量和经济性第二页，共八十七页，2022年，8月28日三、确立有效成分的测定方法1、蛋白质初步提取和浓缩

吸附法超滤法沉淀法（盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀）透析第三页，共八十七页，2022年，8月28日三、确立有效成分的测定方法2、蛋白质高效分离纯化

色谱法（凝胶过滤、离子交换、亲和色谱等）电泳法

（聚丙烯酰胺凝胶、等电聚焦、毛细管电泳等）第四页，共八十七页，2022年，8月28日3、根据蛋白质性质确立分离方法溶解度不同：等电点，有机溶剂，盐析电荷不同：电泳，离子交换分子形状大小不同：离心，透析，凝胶过滤第五页，共八十七页，2022年，8月28日四、蛋白质的制备流程：原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物细胞破碎碎片分离清液－胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性第六页，共八十七页，2022年，8月28日首先：材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的萃取第七页，共八十七页，2022年，8月28日第二节材料的选择、预处理与保存一、原料选择原则：有效成分含量高、原料来源丰富，易得；原料中杂质含量少；原料成本低等；植物采收具有季节性微生物生长的对数期注意动物的年龄与性别第八页，共八十七页，2022年，8月28日微生物：及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。二、原料的预处理：动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。植物原料：要择时采集并就地去除不用的的部分，有用部分保鲜处理。第九页，共八十七页，2022年，8月28日（3）防腐剂保鲜：常用乙醇、苯酚等。适用于液体原料，如发酵液、提取液等。三、原料的保存方法（1）冷冻法：适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。（2）有机溶剂脱水法：丙酮，该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。第十页，共八十七页，2022年，8月28日第三节细胞破碎一、破碎方法的原则和依据原则：最大提取、不易变性、减少干扰具体须从材料特性和目的物特性综合考虑。第十一页，共八十七页，2022年，8月28日1、材料细胞的特性动物细胞无细胞壁，易破碎，只需用温和方法植物细胞有细胞壁难破碎，须用中等或强度大的方法微生物细胞较复杂，一般用较强的方法第十二页，共八十七页，2022年，8月28日2、目的物的特性⑶.处理量

有些处理量大，如组织捣碎机等。有些处理量少，如超声波破碎等。

⑴．细胞中的位置游离状：只需温和破碎，除去不溶部分。结合状：结合在膜或细胞器内，先收集膜或细胞器，再破碎⑵．敏感性

温度、pH、氧、剪切力、杂酶等影响第十三页，共八十七页，2022年，8月28日㈠机械法1.组织捣碎机：

适用：动植物组织二、破碎方法原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞具体方法：2.匀浆器

适用：较柔软、易分散的组织细胞3.研钵

适用：微生物（细菌）与植物细胞第十四页，共八十七页，2022年，8月28日㈡物理法1．超声波破碎2．渗透压冲击法：适用：处理胞壁较脆弱的微生物。细胞放在高渗溶液中，由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内，使细胞快速膨胀而破裂第十五页，共八十七页，2022年，8月28日3．反复冻融法：-15℃～-20℃，适用：动物材料将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。4．急热骤冷法：

85～90℃数分钟，冰浴冷却适用：细菌及病毒中对热不太敏感的物质第十六页，共八十七页，2022年，8月28日㈢．化学法2．

表面活性剂法

破坏细胞膜，释放目的物（需与其它方法结合应用）。

1．

溶剂处理法：

丙酮、氯仿、甲苯等溶解胞膜上脂质化合物，使细胞结构破坏。第十七页，共八十七页，2022年，8月28日（四）酶解法2．

外加酶法

将细胞壁分解，使内含物释放出来。细菌：加溶菌酶（结合反复冻融或加EDTA）酵母：采用β-葡聚糖酶霉菌：添加几丁质酶植物材料：加纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等。1．

自溶法保温一定时间，通过细胞本身的酶将细胞破坏。第十八页，共八十七页，2022年，8月28日例：外源蛋白在大肠杆菌中的积累蛋白0产物占菌体总蛋白/%外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包含体β-丙酰胺酶20%在细胞间区γ-人体干扰素25%形成包含体凝乳酶原形成包含体牛生长激素>30%形成包含体β-内酰胺酶形成间区包含体人胰岛素原5%~26%形成包含体三、包含体及其纯化第十九页，共八十七页，2022年，8月28日包涵体（inclusionbodies），或包含体，是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包涵体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包涵体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。第二十页，共八十七页，2022年，8月28日包涵体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包涵体后，溶解包涵体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包涵体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（proteinfolding）机理研究提出了新的课题。第二十一页，共八十七页，2022年，8月28日重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素－６、人γ－干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒－包涵体（inclusionbodiesIBs)。第二十二页，共八十七页，2022年，8月28日2、包含体的构成基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。分离包含体后，需使目标蛋白恢复应有的天然活性。（蛋白质折叠）包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。第二十三页，共八十七页，2022年，8月28日3、包含体特点:是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。包含体难溶于水，易溶于变性剂（如盐酸胍、脲）。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，离心（5000-20000g15min）就可以沉淀。第二十四页，共八十七页，2022年，8月28日几种常见的工艺路线（一）机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）差速离心提取出包含体加变性剂溶解除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法第二十五页，共八十七页，2022年，8月28日路线1的特点

特点:用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单。

缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。基因工程包含体的纯化方法第二十六页，共八十七页，2022年，8月28日几种常见的工艺路线（二）机械破碎膜分离除可溶性蛋白加变性剂溶解包含体除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法第二十七页，共八十七页，2022年，8月28日路线2的特点优点：应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，封闭式操作，不污染环境也不受环境污染。基因工程包含体的纯化方法缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常导致可溶性蛋白质的滞留。第二十八页，共八十七页，2022年，8月28日几种常见的工艺路线（三）化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片除变性剂复性基因工程包含体的纯化方法第二十九页，共八十七页，2022年，8月28日路线3特点：基因工程包含体的纯化方法优点：化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点：所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。第三十页，共八十七页，2022年，8月28日一、概述第四节萃取1、基本概念及分类概念：萃取是利用溶质在互不混溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的技术。第三十一页，共八十七页，2022年，8月28日液-固萃取液-液萃取化学萃取物理萃取双水相萃取超临界萃取萃取原理参与溶质分配的两相不同分类：第三十二页，共八十七页，2022年，8月28日概念：用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为固-液萃取，也称浸取或浸出。应用：用温水从甜菜中提取糖，用有机溶剂从大豆、花生等油料作物中提取食用油，用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。液-固萃取第三十三页，共八十七页，2022年，8月28日用溶剂从溶液中抽提物质叫液-液萃取，也称溶剂萃取。经典的液-液萃取指的是有机溶剂萃取液-液萃取有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物工业规模的提取上。应用比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低；生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制优点第三十四页，共八十七页，2022年，8月28日溶剂萃取法和其他新型分离技术相结合，产生了一系列新型分离技术：超临界流体萃取（Supercriticalfluidextraction）反胶团萃取（Reversedmicelleextraction）双水相萃取技术（Partitionoftwoaqueousphasesystem）液-液萃取用于高品质的天然物质、胞内物质（胞内酶、蛋白质、多肽、核酸等）的分离提取上。第三十五页，共八十七页，2022年，8月28日根据萃取原理分类的基本概念化学萃取利用脂溶性萃取剂与溶质之间发生化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相分配的过程。物理萃取溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡而进行萃取的分离过程。第三十六页，共八十七页，2022年，8月28日2、萃取技术的操作特点①萃取过程具有选择性②能与其他纯化步骤相配合③适用于各种不同的规模④传质速度快，生产周期短，便于连续操作

第三十七页，共八十七页，2022年，8月28日3、萃取需要考虑下列问题①生物系统的错综复杂和多组分特性②产物的不稳定性③相分离性能第三十八页，共八十七页，2022年，8月28日把目标物质从第一个液相中依靠更强大的溶解力抽提到第二个液相中。物质的溶解和相似相溶原理。萃取是通过溶质在两个液相之间的竟争性溶解（分配）而实现的。二、溶剂萃取技术（液-液萃取）第三十九页，共八十七页，2022年，8月28日影响萃取操作的因素：温度pH值盐分温度↑互溶性增大；温度↓产物稳定性提高，粘度增加，扩散性能减小。影响分配系数，影响物质解离情况无机盐类如硫酸铵、氯化钠等一般可降低产物在水中的溶解度而使其更易于转入有机溶剂相中，另一方面还能减小有机溶剂在水相中的溶解度。盐分↑分配系数↑第四十页，共八十七页，2022年，8月28日d．乳化分散非均相一种另一种乳剂均相（溶液）乳化即水或有机溶剂以微小液滴分散在有机相或水相中的现象。第四十一页，共八十七页，2022年，8月28日乳化剂类型乳状液可分为两大类型水包油，O/W，油分散在水中油包水，W/O，水分散在油中O/W(水包油型)W/O(油包水型)第四十二页，共八十七页，2022年，8月28日（亲憎平衡值）HLBHLB数即亲水与亲油平衡程度，HLB数越大，亲水性越强，形成O/W型乳浊液，HLB数越小，亲油性越强，形成W/O型乳浊液。第四十三页，共八十七页，2022年，8月28日乳化与去乳化在发酵液中，蛋白质是引起乳化的最重要的表面活性物质。

由蛋白质引起的乳化多为水包油型（O/W）。乳化带来的问题：有机相和水相分相困难，出现夹带。第四十四页，共八十七页，2022年，8月28日破乳的方法：1.加热破乳升温加速乳状液液珠的布朗运动使絮凝速率加快，同时使界面粘度迅速降低，使聚结速率加快，有利于膜的破裂。2.高压电破乳高压电场的破乳较复杂不能只看作扩散双电层的破坏，在电场下液珠质点可排成一行，呈珍珠项链式，当电压升到某一值时，聚结过程在瞬间完成。第四十五页，共八十七页，2022年，8月28日3.过滤破乳当乳状液经过一个多孔性介质时，由于油和水对固体润湿性的差别，也可引起破乳。4.化学破乳化学破乳的原则是破坏吸附在界面上的乳化剂，使其失去乳化能力。常用的是使用破乳剂。破乳剂也是一种表面活性剂，有很高的表面活性，能将界面上原来存在的乳化剂顶替走；但破乳剂分子一般具有分支结构，不能在界面上紧密排列成牢固的界面膜，从而使乳状液的稳定性大大降低。第四十六页，共八十七页，2022年，8月28日5.电解质破乳对于稀的乳状液，起稳定作用的是扩散双电层，加入电解质可破坏双电层，也能使乳状液聚沉第四十七页，共八十七页，2022年，8月28日三反胶束萃取

（反胶团萃取）第四十八页，共八十七页，2022年，8月28日1、基本术语胶束(micelles):

向水中加入表面活性剂，水溶液的表面张力随[S]增大而下降。当[S]达到一定值后，溶液的表面张力不再随表面活性剂浓度的增大而降低。临界胶束浓度(criticalmicelleconcentration,CMC):

S在水溶剂中形成胶束的最低浓度。第四十九页，共八十七页，2022年，8月28日反胶束(reversemicelles):若向有机溶剂中加入一定浓度S和水，在有机溶剂中所会形成内部含少量水的胶束。微水相或“水池”(waterpool)：反胶束内溶解的水。第五十页，共八十七页，2022年，8月28日第五十一页，共八十七页，2022年，8月28日2 反胶束的溶解作用微水池溶解和分离作用：

反胶团的微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子,为生物分子提供易于生存的亲水微环境.因此,反胶团萃取可用于氨基酸、肽和蛋白质等生物分子的分离纯化，特别是蛋白质类生物大分子。第五十二页，共八十七页，2022年，8月28日2 反胶束的溶解作用溶解推动力A 静电作用：

理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中,左图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化,当pH<7,即在带正电荷的pH范围内蛋白质的溶解率接近100%,说明静电相互作用对蛋白质的反胶团萃取起决定性作用。第五十三页，共八十七页，2022年，8月28日2、反胶束的溶解作用B 空间相互作用

盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应,含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小,空间排阻作用增大,pro溶解下降.如，AOT/异辛烷系统的含水率与I-0.5成正比。图还示：AOT/异辛烷系统的含水率与AOT浓度无关,这是多数反胶团系统的共性.第五十四页，共八十七页，2022年，8月28日3、反胶束萃取的影响因素1)pHvalueAOT=二-(2-已基已基)琥珀酸酯磺酸钠。第五十五页，共八十七页，2022年，8月28日2)盐浓度盐浓度W0S&ProZ选择性第五十六页，共八十七页，2022年，8月28日3)、盐离子的种类第五十七页，共八十七页，2022年，8月28日4)蛋白质分子量M第五十八页，共八十七页，2022年，8月28日5)、表面活性剂SA 种类B [S]第五十九页，共八十七页，2022年，8月28日6)助表面活性剂第六十页，共八十七页，2022年，8月28日4、应用1)蛋白质分离第六十一页，共八十七页，2022年，8月28日2)胞内酶的提取第六十二页，共八十七页，2022年，8月28日四、超临界流体萃取

SupercriticalFluidExtraction第六十三页，共八十七页，2022年，8月28日简介：超临界流体萃取(SCF)是20世纪70年代后期迅速发展起来的一种新兴的萃取分离技术，是利用超临界流体作为萃取剂，对物质进行溶解和分离的过程。超临界流体具有气体和液体之间的性质，且对许多物质均具有很强的溶解能力，分离速率远比液体萃取快，可以实现高效的分离过程。第六十四页，共八十七页，2022年，8月28日超临界流体的发展

1822年，首次报道1879年，发现超临界流体对固体有溶解能力1970年从咖啡豆提取咖啡因1992年，首先报道了超临界聚合反应第六十五页，共八十七页，2022年，8月28日（一）、超临界流体的萃取的原理1.流体的临界特征气相、液相、固相三相成平衡态共存的点叫三相点。液、气两相成平衡状态的点叫临界点。在临界点是所要求的温度和压力分别称为临界温度（Tc）和临界压力（pc）。稳定的纯物质及由其组成的固定组分混合物具有固有的临界状态点。第六十六页，共八十七页，2022年，8月28日超临界流体(SCF)第六十七页，共八十七页，2022年，8月28日2.超临界流体的特征超临界流体(SCF)是处于临界温度和临界压力以上的非凝缩性的高密度流体。超临界流体没有明显的气-液界面，既不是气体，也不是液体，是一种气-液不分的状态，性质介于气体和液体之间。流体处于超临界状态时，其密度接近液体密度，并且随流体压力和温度的变化发生十分明显的变化。第六十八页，共八十七页，2022年，8月28日超临界流体的性质

物理特征密度（g/cm3）粘度（g/cm/s）扩散系数（cm2/s）气体（0.6-2）*10-3（1-4）*10-40.1-0.4)*10-2液体0.6-1.6（0.2-3）*10-2（0.2-2)*10-5SCF0.2-0.9（1-9）*10-4（0.2-0.7)*10-3第六十九页，共八十七页，2022年，8月28日超临界流体的主要特性

密度类似液体压力和温度的变化均可改变相变粘度,扩散系数接近于气体SCF的介电常数，极化率和分子行为与气液两相均有着明显的差别第七十页，共八十七页，2022年，8月28日溶质在超临界流体中的溶解度随超临界流体密度的增大而增大。2.超临界流体的特征超临界流体萃取正是利用这种性质，在较高压力下，将溶质溶解于流体中，然后降低流体溶液的压力或升高流体溶液的温度，使溶解于超临界流体中的溶质因密度下降，溶解度降低而析出，从而实现特定溶质的萃取。第七十一页，共八十七页，2022年，8月28日可作为超临界流体的物质：二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨等。第七十二页，共八十七页，2022年，8月28日常用的流体介质

二氧化碳：临界温度：31.1℃；临界压力：7.2MPa临界条件容易达到、化学性质不活泼、无色无味无毒、安全性好、价格便宜、纯度高、容易获得等优点第七十三页，共八十七页，2022年，8月28日3.超临界流体萃取特点(优点)①萃取和分离合二为一②压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数③萃取温度低④临界CO2流体常态下是气体，无毒⑤超临界流体的极性可以改变第七十四页，共八十七页，2022年，8月28日4.萃取技术的应用举例

生物活性物质和生物制品的提取

CO2萃取技术主要应用于有害成分成分的脱除、有效成分的提取、食品原料的处理等几个方面。例如：用SFE从咖啡、茶中脱咖啡因；啤酒花萃取；从植物中萃取风味物质；从各种动植物中萃取各种脂肪酸、提取色素；从奶油和鸡蛋中去除胆固醇等。第七十五页，共八十七页，2022年，8月28日例1脱咖啡因超临界流体萃取技术得到最早大规模的工业化应用的是天然咖啡豆的脱咖啡因。用SF-CO2法从咖啡豆中脱出咖啡因工艺流程

第七十六页，共八十七页，2022年，8月28日例2.啤酒花萃取普通的有机溶剂萃取法制取的啤酒花萃取液为暗绿色膏状（即啤酒花浸膏），含有许多不纯物质，而且还残留有机溶剂。液体CO2和SC-CO2抽提的酒花萃取物颜色为微榄绿，在20～25MPa，40℃萃取4h，浸膏得率可14％，硬树脂萃取率仅为5.2%，而且不萃取农药，芳香成分不氧化。第七十七页，共八十七页，2022年，8月28日例3.其他从工业性应用的萃取分离角度，SC-CO2萃取技术在医药、食品、化妆品等工业领域中有较宽的应用面。①医药工业

酶、维生素等的精制回收动植物中药效成分的萃取（生物碱、生育酚、EPA、DHA、鸦片、吗啡、精油等）医药品原料的浓缩、精炼、脱溶剂酵母、菌体产物的萃取第七十八页，共八十七页，2022年，8月28日②食品工业

植物油脂的萃取动物油脂的萃取奶脂中脱除胆固醇等食品脱脂咖啡、红茶脱咖啡因、酒花萃取香辛料萃取植物色素的萃取共沸混合物分离，含醇饮料的软化脱色、脱臭，烟草脱尼古丁第七十九页，共八十七页，2022年，8月28日③化妆品及香料工业天然香料萃取，合成香料的分离和精制化妆品原料萃取，精制（界面活性剂、脂肪酸脂、甘油单酯等）第八十页，共八十七页，2022年，8月28日

1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有大部分琼脂(或可溶性淀粉)。再如下图中，2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系

五、双水相萃取第八十一页，共八十七页，2022年，8月28日有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（85～95％），蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。双水相萃取的优点使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；第八十二页，共八十七页，2022年，8月28日（一）、双水相体系的组成双聚物：