筛选与单克隆挑取

****G418筛选原理及方法分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列(neo抗性基因)携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。G此，特性明确的细胞====================================================细胞系或机体中国仓鼠卵巢细胞盘基网柄菌属母G418浓度(ug/ml)700~80010~35125~500====================================================由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以加药时间不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳方法：()lGgml的完全培养液，每个浓度设3个平行孔，三天一换液，继续培细胞维持培养的浓度。6.确定最佳筛选浓度：在筛选10~14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出a转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％~ 养，待其逐渐增大后；其它抗生素。4、由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，G加抗生素的时机：主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。一般是转染48小时后加入抗生素。挑。而且，如果你要挑选到几个阳性克隆中较高表达的克隆的话，可以调整抗生素的浓度。当然，抗性基因高表达，目的基因不一定就跟着高表达。6、体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要a培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液的预试验，效果就很好了。后面做正式的稳定转染以及单克隆筛选什么的都没有问题，至今稳定转染的细胞株还长得定要根据自己对该种细胞的熟悉程度，例如接种多大密度多长时间可以长满等等来最终确定，每种细胞的性情都是不同。预试验嘛，本身就是摸索。它抗生素。 GGG汇合度(confluence)也许是我们实验室的翻译，实际上就是指细胞占培养表面的比例，如果细胞铺满了整个容器，我们2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起(我的细胞簇离的很近)，c、显微镜下观察细胞完全松散开，就可以在你感兴趣的局部加培养基，并吸走你的可隆了呀能够被吸走为止。的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。培养SPC-A1(人肺癌细胞)，转所帮助。lml第三排……，一直到第八排，最后一排都丢弃0.1ml细胞液，操作示意图见下图。一般来说，每一列都会有某个孔中单个荧光细胞圈住，然后在操净台里用灭过菌底牙签将圈外的细胞戳死，这样留在孔中的就是单克隆了，通过这样的，我一96板，在里面随便种一些细胞，然后用牙签练习，我练了5~6次后非常熟练了。过滤后的培养含有很多生长因子，可以作为单克隆的培养液。方法4。我曾经帮同事做过挑单克隆，直接将倒置显微镜搬到操净台内紫外照射30分钟，然后先在显微镜下把要挑的好擦擦，将显微镜用新洁尔灭也擦一下，一般不会有什么问题)，你可以试试，只要小心一些就行了。 2)转染后一天消化，传到一个大皿(1：6)或者两个大皿(1：12)。3)再过一天后加入带G418的培养基。4)依据细胞不同，大概从加入G418的第三天到第八天之间细胞开始出现大量死亡，活下来的细胞就形成单克隆。ul块24孔板上。le形成的细胞集落就少，而且真阳性也较少。对于那些转染效率很低的细胞，我会连续转染三次(中间如果细胞长满了就传代)，好像比较有效。除非是类似带GFP这样能直接观察到是否真阳性的基因，我们才用有限稀释法来作，要不好像也太麻烦了吧？耗时也多。12、转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？无怪乎两种形式：整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关，如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。某些载体如pcDNA3包含几率。对普通的表达载体来说，即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目因有一定的联锁，并不是完全相互独立的。只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。一般能挑到稳定表达维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。拷贝整合的高表达的克隆？ neo的产物是酶，过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓G嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解要看细胞生长情况和培养基的状况，刚加药时细胞死亡不多，很快培养基就会变酸变黄，要根据情况及时换液。筛选中期会有大批细胞死亡，要根据死亡细胞多少换液以去除死亡细胞。18、通过筛选后没有死亡的细胞不能直接用吗？一定要单克隆吗？难道单克隆一次还不够还要再来一次吗？大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了。必须指出，单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是19、筛选后的细胞和原来的细胞性状差异很大这正常吗？基本算正常，稳定转染的细胞据细胞种类不同其形态都较正常细胞有变化，有的很明显，比如说细胞变大，生长缓慢，方面防止细胞回复，因为你转入的质粒对于细胞而言毕竟是个负担，细胞较倾向于甩掉负担轻装前进，这一点对于肿瘤细胞尤甚；另一方面，如果插入的质粒明显和细胞周期有关的话，这种稳定转染的细胞传不了几代就会死亡。在传G的细胞。也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用96孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不个板,100万个细胞就需要100个板,对于转基因细胞筛选或基因打靶,工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下,远远不如千万个细胞共同培养活力好.因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选,需要的单细胞克隆株数量多少?文献后发现没有一个定论的说法。即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。1)正式试验前先要根据你的细胞做好预试验细胞死亡这是很正常的现象，这些细胞都是所不需要的。2。我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。我自己认为，从理论上讲，如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。不知这种观点对不对。然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选 我应该保持这个浓度多少天才能确保我筛选完成呢？在这期间可以换液吗？筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中是否还应该加一定浓度的G418？如果要加的话什么浓度比较合适？液一次。筛选完了之后存活的细胞再培养传代的话，培养基中应该加一定浓度作步骤有问题吗？看了你的操作步骤，个人观点认为你挑出来的不能称之为单克隆，在6孔板里用G418筛选两周后只是大部分细胞死克隆化的操作(具体操作方法见附件)。从严格意义上来讲，单克隆化的操作一般要进行2-3次，经此操作后长起来的才能称之为单克隆。另外，在把克隆或单克隆放大的过程中动作一定要轻柔，否则很容易出现你所说的细胞不贴壁死冻存，以备后续试验。25、我想问怎样的方法可以把阳性克隆从培养瓶中取下来，书上说用弯头吸管，我试了，不好用，根本就不能完整的如何挑选克隆。你可以按以下操作方法进行：(1)将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将各个克隆位置用标记笔标记准确；(2)在超净台内，弃去培养皿内的培养液；(3)用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%Trypsin消化液浸湿，置于所标记克隆位置处，5-20秒；(有人可提前在一孔中(4)将24孔培养板每孔加G418选择培养基2ml，用镊子取出已黏附克隆细胞的滤纸快，置于一个孔中的培养基中，步鉴定工作。****单克隆挑取为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除发结合有隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或者用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选。鉴定之后 一般经过4周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过2次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。具体方法：mm纸封口高压灭菌.5.消化一定时间后(根据你消化该细胞所需时间),将滤纸片取出,立即转移至事先加有培养液的6孔板中.6.扩大培养即可.的就是不要摇动平皿，那样会使克隆不纯。****转染和筛选：1.使用含编码抗生素抗性基因表达序列的质粒(如pSV2neo)转染细胞。定。含抗生素的培养基每周更换两次。细胞。****单克隆化后细胞特点和处理：1.单克隆后细胞生活习性改变：考虑质粒的表达对细胞的生长有一定的影响，查文献确认一下。2.单克隆后的培养需要多加些血清，再传代时保证板子不影响细胞贴壁，避免出现传代后细胞浮起来后死亡的现象。因此做功能时要停药培养合适时间后再做。PA317细胞后再此筛选(需要隔一段时间再加压筛一次)，细胞也是死的厉害，不过还是可以筛到，不过需要用GG度培养一天看细胞会不会死亡，如果死亡，说明外源基因还没有丢失。时你得到的细胞株可能失去了此启动子,或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下!2.转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后(传代10代以上)还表达你想要蛋白的单克隆可以认为是整合了质****进行真核转染的一般程序：克隆目的基因(经测序验证)—准备真核表达载体－将目的基因插入表达载体中－转染－筛选－鉴定滤过除菌。 二、操