第十二章单克隆抗体

第十二章单克隆抗体第一页，共三十四页，2022年，8月28日1二、动物细胞代谢葡萄糖和谷氨酰胺提供能量和合成代谢的前体葡萄糖受限谷氨酰胺谷氨酰胺：氮源，受限，消耗其他氨基酸葡萄糖代谢：进入糖酵解途径，大部分分解为丙酮酸乳酸，分泌到胞外（积累）丙酮酸还可以转化为乙酰辅酶A，进入TCA循环，彻底氧化为CO2和水

4%-8%的少部分葡萄糖进入五糖磷酸途径PPP，转化为4、5、7碳糖和NADPH.5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。

葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，产生细胞毒性。

谷氨酰胺代谢：进入氨基酸代谢途径，合成其他氨基酸

大多数谷氨酰胺在脱氨酶作用下，生成谷氨酸，并释放氨，产生细胞毒性小部分谷氨酰胺通过转氨作用生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖。谷氨酰胺谷氨酸还原酶α-酮戊二酸TCA能量在快速生长的培养系中，转氨作用是主要代谢途径：

谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用丙氨酸和天冬氨酸葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸常流加葡萄糖代谢和谷氨酰胺，控制整个代谢，避免有毒废物积累

第二页，共三十四页，2022年，8月28日三、动物细胞的分类原代细胞（primarycell):从动物体内直接分离得到的细胞

特点：生长分裂不旺盛，与体内细胞相似

传代细胞（passagecell):原代细胞转接后培养的细胞特点：分裂增殖旺盛二倍体细胞系（diploidcell):原代细胞经过传代、筛选、克隆、纯化后，获得的具有一定特征的细胞系。

如：W1-38,MRC-5,ZBS等有限细胞系(finitecell):生长和寿命有限的细胞系，二倍细胞系特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡（寿命取决于细胞来源的物种、年龄和器官）人细胞：50-60代，胚成纤细胞：人50代；鸡胚30代；小鼠8代第三页，共三十四页，2022年，8月28日三、动物细胞的分类（二）无限细胞系(infinitecell):生长和寿命不受限制的细胞系，能连续传代培养。

特点：细胞无限分裂，不具有接触抑制现象，不出现异常染色体连续细胞系(continuouscellline)永久性细胞系（immortalcellline)异倍体工程细胞系（engineeredcellline):采用基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰，获得具有稳定遗传的独特性状。获得方法：异倍体化，融合或重组转化细胞系：染色体断裂成为异倍体，失去了正常细胞的特点，具有无限增殖能力。特点：可长期培养，倍增时间短，对培养条件和营养要求较低，适用于大规模培养如：Namalwa,CHO,BHK-21,Vero细胞等。√√√第四页，共三十四页，2022年，8月28日四、动物细胞培养的特性

4.1.细胞生长缓慢，分裂周期12～48h，易受微生物污染；4.2.动物细胞较微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差；4.3.培养过程需氧量少，且不耐受强力通风与搅拌；4.4.在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程（电荷作用，钙镁离子作用）具有群体效应，锚地依赖性，接触依赖性及功能全能性；→接触抑制（contactinhibition）现象。4.5.培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵；（注：多数分泌胞外，收集纯化方便，得到较完善的翻译后修饰，特别是糖基化，与天然产品一致）4.6.大规模培养时，不可套用微生物反应的经验；有限细胞系（finitecellline）第五页，共三十四页，2022年，8月28日五、动物细胞的培养基组成与制备

5.1.培养的环境因素

温度（37±0.5）oC；渗透压（生理条件下）260～320mOsm/Kg

氢离子浓度

7.2～7.4，接近中性（不能超过6.8～7.6）其它有机离子主要代谢物补充的代谢物激素影响细胞代谢的其他因素细胞生长的基质各因素间的相互作用5.2.主要因素：培养基组成和浓度温度培养液的酸碱度

溶解氧（O2、CO2）—95%空气，5%CO2混合气体，氧的传递非常困难（40%—50%）合适各种代谢物浓度第六页，共三十四页，2022年，8月28日5.3培养基组成5.3.1.AA；5.3.2.维生素类；VB或VB+VC

5.3.3.盐类Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、SO42-、PO43-、HCO3-调节渗透压酸碱平衡、酶的活性等；5.3.4.葡萄糖—能量；

5.3.5.缓冲系统—磷酸盐

CO2→HCO3-；5.3.6.矿物质—来源于血清，无血清时，补充Fe2+、Cu2+、Zn2+、Se2+

和其他稀有元素；5.3.7.有机补充物，如核苷类，TCA循环中间产物、丙酮酸盐、类脂等；5.3.8.激素

如胰岛素、生长激素；5.3.9.生长因子类

各来自于血清中，存在的是一些多肽；粘附因子，如纤维结合蛋白、胶原等。

关键因素：葡萄糖；谷氨酰胺；能源浓度高氧气第七页，共三十四页，2022年，8月28日

DMEM培养基（mg/L）

L-盐酸Asg42，L-cys24，L-Asn584，L-盐酸His19，L-zle52，

L-Leu52，L-盐酸Lys72，L-Met15，L-Phe36，L-Thr48，L-色氨酸8，L-酪氨酸36，L-缬氨酸48，氯化胆碱，叶酸3，肌醇6，烟酸3，泛酸钙3，盐酸吡哆醛3，核黄素0.3，硫胺素3，生物素3，NaCl6800，KCl400，CaCl2200，MgSO4·7H2O200，

NaH2PO4·2H2O150，NaHCO32000，Glucose1000。青霉素100U/ml，链霉素100U/ml，50mg/mL庆大霉素10%小牛血清，

1%非必需氨基酸,0.1mol/L丙酮酸钠，1%谷氨酸胺

第八页，共三十四页，2022年，8月28日

六、动物细胞培养方法与操作方式

6.1细胞培养方式6.1.1.体外培养的动物细胞分为两种类型：非贴壁依赖性细胞→悬浮培养（anchorage-independent）→血液、淋巴组织、肿瘤细胞。6.1.2.贴壁依赖性细胞→贴壁培养（anchorage-dependent）→大多数动物细胞（吸着于带正电荷的固体或半固体表面上生长）其生长必须有给以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌或培养基中提供的贴附因子（attachmentfactor）才能在该表面上生长、繁殖。6.1.3.兼性贴壁细胞：如中国地鼠卵巢细胞。小鼠L929细胞。第九页，共三十四页，2022年，8月28日

贴壁培养

成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成骨细胞等中胚层细胞。上皮细胞、皮肤细胞等外胚层细胞和内胚层细胞。滚瓶系统培养→微载体系统培养法（搅拌罐）

（搅拌槽，中空纤维管）

粘附比率（玻璃、纤维素、明胶等增加了比表面积）。接种细胞密度104/cm2→(1～2)×105/cm2(劳动密集型)

悬浮培养小规模：转瓶或滚瓶大规模：细胞反应器（空气提升式、中空纤维管、搅拌槽）与微生物细胞相比较缺点：细胞密度较低（1～2)×105个/mL→(1～3)×106个/mL。

(操作简单、易于放大、均匀、易于控制)固定化培养（流化床、固定床）第十页，共三十四页，2022年，8月28日

6.2细胞培养操作方式

分批式流加式半连续式连续式灌流式注意：生物污染（其它动物细胞、微生物、病毒）控制关键：实时检测。第十一页，共三十四页，2022年，8月28日

七、动物细胞大规模培养系统

气生式细胞培养系统

微载体培养系统

微束培养系统

大载体系统

中空纤维培养系统

通气搅拌细胞培养系统第十二页，共三十四页，2022年，8月28日抗体（Antibody.Ab）是有抗原刺激机体后，由淋巴B细胞经分化增殖的浆细胞合成的分泌的，能与响应抗原特异结合并具有多方面免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（Immunoglobin,Ig）是只具有抗体活性或其化学结构与抗体相似的球蛋白。Ab与Ig是同义体，已知相应配体的Ig称为抗体。

一、基本概念第二节抗体第十三页，共三十四页，2022年，8月28日

理化性质及免疫学特性

是机体体液免疫的主要成分

血液中（主要）环境其他体液外分泌液人的抗体分为五类IgGIgAIgMIgDIgEIg的生化本质：大分子蛋白；具有抗体活性；

本身带有多种抗原决定簇，具有一定的

抗原特异性。抗原（Antigen）：诱发机体产生抗体的外来物质。

二、抗体的分类第十四页，共三十四页，2022年，8月28日三、抗体条件：

1.只有脊椎动物（鱼类以上）的浆细胞才能产生；2.必须要有抗原物质的刺激；3.能与相应的抗原发生特异性结合；4.其化学本质是一类具有免疫功能的球蛋白。杂交瘤技术蛋白质工程技术（疾病治疗、诊断）应用广泛

发展前景转基因第十五页，共三十四页，2022年，8月28日

三、抗体分子的结构和功能

3.1抗体分子的结构两条轻链（lightchain,L）

两条重链（heavychain,H）二硫键连接L:210个AA残基，分子量2.3×104H:450个AA残基，分子量5.0×104L和H内部具有一系列重复的同源结构单元，每个单元长约110个AA残基。“Y”字形结构，在“Y”字的的两个支角上，占轻链1/2和占重链的1/4.N端是抗原识别位点。抗体的结构示意图第十六页，共三十四页，2022年，8月28日抗体的功能区（domain）折叠成球状结构（AA排列顺序因抗体的特异性而异）称可变区（Variableregion,简称V区），包括3个互补决定区（VH，VL）（compiementarity-determiningregion;CDR）羟基-侧，AA排列顺序较恒定→恒定区（constantregion,c区）H链上有3个C区，CH1，CH2，CH3L链上有1个C区，CL铰链区：H链的中间部分肽段。“Y”→“T”互变，不结合抗原，CH2区的补体结合位点被掩盖。第十七页，共三十四页，2022年，8月28日木瓜蛋白酶作用后：Fab片段：抗原结合活性和特异性，一条完整

的L链和H链的VH区以及CH1Fab片段：两条H链的CH2和CH3区域Fc片段：无抗原结合活性，但是抗体结合了抗

原以后，激活机体免疫反应的主要部位。

抗体分解的三个部分第十八页，共三十四页，2022年，8月28日

主要激活以下免疫反应：(1)激活补偿功能系统。(2)产生抗体依赖性细胞介导毒素。(3)可结合巨噬细胞的Fc受体，使巨噬细胞吞食并毁灭抗原—抗体复合体。根据抗体重链的C区（CH）的不同，将人的重链分为γ、μ、ε、δ和α五大类。→形成的Ig分别称为IgG，IgM，IgE，IgA和IgD。第十九页，共三十四页，2022年，8月28日3.2抗体的功能

中和毒素

固定微生物生物学功能

中和病毒

凝集抗原颗粒

结合并沉淀可溶性抗原

激活血清补体等。第二十页，共三十四页，2022年，8月28日

各类Ig各司其职，共同完成的机体免疫防护任务（1）IgG最主要的免疫球蛋白，15%，

参与几乎所有的体液免疫反应。作用：免疫凝集、免疫沉淀、免疫调理、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、激活补体系统、固定细菌和中和病毒。（2）IgA机体粘膜局部防御的重要作用因素

功能：杀菌、抗病毒活性和免疫凝集作用（分泌型IgA）。（3）IgM血液中

功能：补体激活、防止菌血症和败血症。（4）IgE

（5）IgDPcAb：亲和力高，制备过程简单，用于诊断试剂，毒蛇咬伤（特殊情况）抗蛇毒抗血清（PcAb）治疗优于McAb。第二十一页，共三十四页，2022年，8月28日第三节单克隆抗体多克隆抗体（Polycolonalantibody）：同一抗原产生的不同抗体（含有多个抗原决定簇）单克隆抗体McAb（monocolonalantibody）：由单个淋巴细胞针对某一抗原决定簇产生的单个抗体。（B细胞的纯培养）上市药物:Reopro,Herceptin,Campath-1H,Zevalin等单抗的特点：

①特异性强②重复性好③操作简便易行（临床诊断快速检测等）医学、临床、药理、食品检测、生化等多个领域。应用：癌症诊断、药物测定、传染病诊断、临床治疗(如蛇毒等）第二十二页，共三十四页，2022年，8月28日

骨髓瘤细胞

×B细胞（myelomacell）

体外生长

无限增殖

杂交瘤细胞

单克隆抗体

B淋巴细胞杂交瘤技术（又称单克隆抗体技术）德国

Kohler科勒尔

首次利用细胞融合技术→制备出单克隆抗体英国

Milstein米尔斯坦→并完善了极微量蛋白质检测技术丹麦

Jerne杰恩→1984年诺贝尔生理学及医学奖第二十三页，共三十四页，2022年，8月28日一、杂交瘤细胞的产生

第二十四页，共三十四页，2022年，8月28日1.杂交瘤细胞系的建立1.1.免疫B淋巴细胞的制备

B淋巴细胞即期望能分泌特定抗体的细胞。抗原

种类不受限制。纯度要求不高，在筛选时采用均一的所期望的抗原来检测。第二十五页，共三十四页，2022年，8月28日1.1.2.免疫（1）动物BALB/C小鼠，→BALB/C系列，C57BL/6系列。Lou大鼠

免疫时尽量采用相同的品系动物免疫，与骨髓瘤细胞在种子上尽量一致。（2）免疫方法

应考虑抗原的性质、纯度、制剂的选择，因抗原而异。通常方法：体内免疫（皮下、肌内、腹腔免疫，适用于颗粒性抗原）脾内免疫（来源有限，昂贵的抗原免疫，效果不好）体外免疫（分离B淋巴细胞，用于人McAb，效力不高）从脾脏或外周血中。（3）免疫程度：

基础免疫一般4～6周，加强免疫后于融合到3～4天，静脉加强。第二十六页，共三十四页，2022年，8月28日

1.2.骨髓瘤细胞

多发性骨髓瘤细胞：SP2/0—Ag14；P3—NS—1—Ag4.1；；YB2—3.0—Ag20。要求：

(1)自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段。(2)处于良好的生长状态（对数生长期最佳）<1×104个/mL，生长缓慢；>106个/mL，细胞分裂停止；（1-5）×105个/mL浓度最好。第二十七页，共三十四页，2022年，8月28日

1.3细胞融合

①免疫脾细胞悬液

经免疫的BABL/C小鼠，摘除眼球放血，处死，无菌摘除脾脏，研磨，经NH4Cl破碎红细胞后，洗涤调整细胞浓度（1-5）×105个/mL②骨髓瘤细胞

传代生长24h的细胞数（1-5）×105个/mL③融合:B淋巴细胞

×瘤细胞

5～10∶1加入50%PEG（4000—6000）融合1min

加入无血清培养液终止融合

洗涤去除PEG

细胞培养液第二十八页，共三十四页，2022年，8月28日

1.4杂交瘤细胞的筛选

HAT培养液1～2周培养选择出杂交瘤细胞

选择出特异性抗体(ELISA法）

1.5杂交瘤细胞的去除

①克隆化96孔板稀释法软琼脂培养法

②选择第二十九页，共三十四页，2022年，8月28日1.6单克隆抗体的制备：①动物体内法：

实验室用（简便、经济），腹水浓度高2～5mg/ml,比培养法高1000—10000倍，对一般用途的McAb的首选方法

②体外培养法(工业化生产法):

体外培养法主要有以下两种：悬浮培养：国际上多用，国内尚空白。固定化培养：贴壁细胞培养，移入载体。

注意：

①与杂交瘤同品系的动物或杂交一代②注意动物的微生物感染③腹水内尚含非特异性抗体，需进行纯化。

第三十页，共三十四页，2022年，8月28日1.7单克隆抗体的进一步鉴定：

①染色体鉴定：小鼠脾细胞染色体40，小鼠骨髓瘤细胞染色体数变异较大，62-69株②特性鉴定：亲和力，酶联免疫吸附测定（ELISA）法③类别鉴定：抗血清/双向免疫扩散法④纯度鉴定：

SDS电泳法第三十一页，共三十四页，2022年，8月28日

第四节抗HBsAg的单克隆抗体生产工艺

抗乙型肝炎表面抗原（HBsAg）单克隆抗体—专一性识别HBs