第三章色谱分析法液相

第三章色谱分析法液相第一页，共八十八页，2022年，8月28日3.1概述（P355）第二页，共八十八页，2022年，8月28日第三页，共八十八页，2022年，8月28日高效液相色谱法对比气相色谱法的相同点基本理论一致：保留值、分配系数、分配比、塔板理论、速率理论等定性、定量原理和方法一致仪器结构和操作技术一致均可与其他仪器联用，以研究复杂混合物第四页，共八十八页，2022年，8月28日高效液相色谱法对比气相色谱法的优点对于高沸点（＞500℃）、热稳定性差，相对分子质量大（M＞400）的有机物（占有机物总数的75～80%）原则上都可分离流动相选择余地广固定相是新型吸附剂，以化学键合固定相居多样品的回收比较容易第五页，共八十八页，2022年，8月28日高效液相色谱法对比气相色谱法的缺点仪器原理及结构有差别流动相性质不同，使速率理论参数不同缺少通用型检测器“柱外效应”对柱效率及色谱分离影响较大流动相价格较高流动相有毒第六页，共八十八页，2022年，8月28日高效液相色谱法的特点高压：150～350×105Pa高速：高效：气相色谱n约为2000塔板/米液相色谱n约为30000塔板/米高灵敏度：紫外检测器：10-9g

荧光检测器：10-11g第七页，共八十八页，2022年，8月28日3.2高效液相色谱的基本理论(P356)色谱分离的基本理论塔板理论

速率理论第八页，共八十八页，2022年，8月28日速率理论

式中A，B，C为三个常数，其中A称为涡流扩散项，B为分子扩散系数，C为传质阻力系数。范弟姆特方程式的简化式第九页，共八十八页，2022年，8月28日3.2.1气相色谱的速率理论

涡流扩散示意图

涡流扩散项A第十页，共八十八页，2022年，8月28日

涡流扩散引起的峰展宽的大小：

A=2λdP

式中：λ为填充不规则因子，它由填料颗粒直径dP、粒度范围和柱填充状况决定。对于空心毛细管柱，A项为零。

第十一页，共八十八页，2022年，8月28日

填料粒径对A项的影响

筛目dp(cm)λA(cm)20～400.04～0.0810.1250～1000.15～0.0330.14200～4000.004～0.00780.09第十二页，共八十八页，2022年，8月28日纵向分子扩散使峰展宽(a)柱内谱带构型(b)相应的响应信号分子扩散项B/u(纵向扩散项)第十三页，共八十八页，2022年，8月28日纵向扩散与组分在柱内的保留时间有关。Dg为组分在气相中的扩散系数（单位为cm2·s-1）。Dg

反比于载气密度（相对分子质量）的平方根。

Dg随柱温增高而增加，但反比于柱压。第十四页，共八十八页，2022年，8月28日γ是因载体填充在柱内而引起气体扩散路径弯曲的因数（弯曲因子）。弯曲因子γ为与填充物有关的因素。若组分通过空心毛细管柱，γ=1；在填充柱中，γ<1。对于硅藻土担体，γ=0.5~0.7。第十五页，共八十八页，2022年，8月28日

气相传质阻力系数Cg

液相传质阻力系数Cl传质阻力项系数C第十六页，共八十八页，2022年，8月28日

传质阻力引起非平衡过程示意图

第十七页，共八十八页，2022年，8月28日所谓气相传质过程（Cg

）是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程，在这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。

对于填充柱

第十八页，共八十八页，2022年，8月28日所谓液相传质过程（Cl

）是指试样组分从固定相的气液界面移动到液相内部，并发生质量交换，达到分配平衡，然后又返回气液界面的传质过程。液相传质阻力系数Cl为

df为固定相的液膜厚度第十九页，共八十八页，2022年，8月28日对于填充式色谱柱，填充均匀程度、担体粒度、保留时间、载气种类、载气流速、柱温、柱压、固定相液膜厚度等对柱效、峰扩张的影响。

第二十页，共八十八页，2022年，8月28日填充柱的u最佳和H最佳第二十一页，共八十八页，2022年，8月28日3.2.2毛细管色谱柱

Golay方程

H=B/u+Cg•u+Cl•u式中，A=0，B=2Dg气相传质系数r0为空心柱内径液相传质系数同填充柱。第二十二页，共八十八页，2022年，8月28日第二十三页，共八十八页，2022年，8月28日3.2.3液相色谱(P356)

He=2λdp

涡流扩散项He(A)第二十四页，共八十八页，2022年，8月28日

0

影响峰扩散的主要物理性质

参数气体液体扩散系数Dm/cm2•s-110-110-5密度ρ/g•cm-310-31粘度η/g•(cm•s)-110-410-2分子扩散项Hd(B)

常数第二十五页，共八十八页，2022年，8月28日

固定相传质阻力项(Hm)

流动相传质阻力项(Hs＋Hsm)传质阻力项(C)第二十六页，共八十八页，2022年，8月28日固定相传质阻力项Hs

式中，df为液膜厚度，Ds为试样分子在固定液内的扩散系数，Cs为与容量因子k有关的系数。

第二十七页，共八十八页，2022年，8月28日流动相传质阻力项

流动的流动相中的传质阻力项Hm

滞留的流动相中的传质阻力项Hsm

第二十八页，共八十八页，2022年，8月28日流动的流动相中的传质阻力项Hm

式中Cm是一常数，是容量因子k的函数，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构。第二十九页，共八十八页，2022年，8月28日滞留的流动相中的传质阻力项Hsm

式中Csm是一常数，它与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及容量因子有关。

第三十页，共八十八页，2022年，8月28日悬浮聚合产生苯乙烯基二乙基苯聚合物的单体颗粒第三十一页，共八十八页，2022年，8月28日第三十二页，共八十八页，2022年，8月28日Giddings方程第三十三页，共八十八页，2022年，8月28日

液相色谱的H-u曲线

第三十四页，共八十八页，2022年，8月28日固定相粒度大小对板高的影响

H近似正比于dp2，减小粒度是提高柱效的最有效途径。第三十五页，共八十八页，2022年，8月28日LC和GC的H－u图

第三十六页，共八十八页，2022年，8月28日柱外效应柱前峰展宽：主要由进样所引起柱后展宽：主要由接管、检测器流通池体积所引起第三十七页，共八十八页，2022年，8月28日

液-固色谱

其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附：

这种竞争吸附达到平衡时：3.3高效液相色谱的类型及其分离原理(P358)第三十八页，共八十八页，2022年，8月28日

液-液分配色谱及化学键合相色谱第三十九页，共八十八页，2022年，8月28日正相液-液色谱法（normalphaseliquidchromatography）：一般为了避免固定液的流失，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性。反相液-液色谱法（reversphaseliquidchromatography）：流动相的极性大于固定液的极性，出峰顺序正好与正相液－液色谱相反。

多分类第四十页，共八十八页，2022年，8月28日

离子交换色谱阳离子交换阴离子交换第四十一页，共八十八页，2022年，8月28日溶剂中的阴离子X-与树脂中的Cl-进行交换，达平衡后，此浓度表示的平衡常数Kx

为：

分配系数Dx

（阴离子交换）为

第四十二页，共八十八页，2022年，8月28日溶剂中的阳离子M+与树脂中的Na＋进行交换，达平衡后，此浓度表示的平衡常数Kx

为：分配系数Dx

（阳离子交换）为第四十三页，共八十八页，2022年，8月28日3.3.4空间排斥（排阻）色谱第四十四页，共八十八页，2022年，8月28日3.3.5高效液相色谱分离类型的选择(P359)

相对分子质量较低，挥发性较高的试样，适于用气相色谱法。标准的液相色谱类型（液-固、液-液、离子交换、离子对色谱、离子色谱等）适用于分离相对分子质量为200～2000的试样。大于2000的则宜用空间排阻色谱法，作出相对分子质量的分布情况。第四十五页，共八十八页，2022年，8月28日第四十六页，共八十八页，2022年，8月28日3.4液相色谱法流动相(P60)

在选择流动相时应注意下列几个因素：流动相纯度：一般为分析纯试剂，必要时需进一步纯化，以除去有干扰的杂质。沸点合适，适应回收不与色谱柱或固定相起化学反应，不溶解固定相，不改变固体吸附剂的吸附活性，不与吸附剂起不可逆反应对试样要有适宜的溶解度：否则会在柱头易产生部分沉淀。溶剂的粘度小，扩散系数大，减小传质阻力应与检测器相匹配第四十七页，共八十八页，2022年，8月28日在选用溶剂时，溶剂的极性为重要的依据

正相液-液色谱，选中等极性的溶剂为流动相。组分的保留时间太短：表示溶剂的极性太大；组分的保留时间太长：表示溶剂的极性太小；再选极性在上述两种溶剂之间的溶剂；多次实验，以选得最适宜的溶剂。例第四十八页，共八十八页，2022年，8月28日正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系第四十九页，共八十八页，2022年，8月28日液-液色谱和液-固色谱常用溶剂的极性顺序排列反相：水（极性最大），甲酞胺，乙腈，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氧六环，四氢呋喃正相：甲乙酮，正丁醇，醋酸乙酯，乙醚，异丙醚，二氯甲烷，氯仿，溴乙烷，苯，四氯化碳，二硫化碳，环己烷，己烷，庚烷，煤油（极性最小）注：为了获得合适的溶剂强度（极性），常采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相。第五十页，共八十八页，2022年，8月28日各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子＞SO42-＞草酸离子＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3COO-＞OH->F-，所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。各种阳离子的滞留次序大致为:Ba2+＞Pb2+＞Ca2+>Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+>Zn2+>Mg2+＞Ag+＞Cs+>Rb+＞K+>NH4+＞Na+>H+>Li+，但差别不及阴离子明显。

离子交换色谱第五十一页，共八十八页，2022年，8月28日3.5液相色谱法固定相(P361)

3.5.1固定相的基本要求载体颗粒细小均匀固定液液膜薄填充剂应耐压载体制作重复性好，寿命长，热稳定性好，耐溶剂，不与样品其化学反应第五十二页，共八十八页，2022年，8月28日3.5.2液－固色谱固定相全多孔型担体（porousmicrobeadssupport）：氧化硅、氧化铝、硅藻土制成的直径为100μm左右的全多孔型担体。目前粒度为5～10μm的全多孔微粒担体是使用最广泛的高效填料。表层多孔型担体：又称薄壳微珠担体（pellicuarmicrobsadssupport）：直径为30-40μm的实心核（玻璃微珠），表层上附有一层厚度约为1～2μm的多孔表面（多孔硅胶）。第五十三页，共八十八页，2022年，8月28日微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型离子交换层惰性核惰性核离子交换剂硅胶层涂覆第五十四页，共八十八页，2022年，8月28日堆积硅珠：纳米二氧化硅凝积成30-40μm的堆积硅珠第五十五页，共八十八页，2022年，8月28日3.5.3液－液分配色谱常用固定液强极性的β，β’－氧二丙腈中等极性的聚乙二醇－400弱极性的角鲨烷第五十六页，共八十八页，2022年，8月28日液-液色谱担体

硅胶、氧化铝、分子筛、聚酞胺等。仍可分为全多孔型和薄壳型两种，其特点如液固色谱的固定相。目前较常使用的是5～10μm的硅胶微粒（全多孔型）。

第五十七页，共八十八页，2022年，8月28日硅氧碳键型（≡Si-O-C）硅氧硅碳键型（≡Si-O-Si-C)硅碳键型（≡Si-C）硅氮键型（≡Si-N）3.5.4化学键合固定相多第五十八页，共八十八页，2022年，8月28日第五十九页，共八十八页，2022年，8月28日时间，min固定相：C1固定相：C8固定相：C18硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。第六十页，共八十八页，2022年，8月28日化学键合固定相的特点

表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。第六十一页，共八十八页，2022年，8月28日3.5.5离子交换色谱法固定相

薄膜型离子交换树脂：以薄壳玻珠为担体，在它的表面涂约1％的离子交换树脂而成。离子交换键合固定相：用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体表面。第六十二页，共八十八页，2022年，8月28日3.5.6排阻色谱法固定相

软质凝胶半硬质凝胶硬质凝胶第六十三页，共八十八页，2022年，8月28日3.6

高效液相色谱仪(P363)

五个部分：

高压输液系统进样系统色谱柱检测系统记录仪第六十四页，共八十八页，2022年，8月28日第六十五页，共八十八页，2022年，8月28日3.6.1贮液器及流动相贮液器：耐腐蚀，能密封。常用不锈钢、聚四氟乙烯、玻璃等。流动相（溶剂）：过0.45μm微孔滤膜，脱气（加热、抽真空、吹氮、超声波）第六十六页，共八十八页，2022年，8月28日3.6.2

输液泵（高压泵）

按性质可分为恒流泵和恒压泵两类：往复式柱塞泵（reciprocatingpistonpump）

100次/min第六十七页，共八十八页，2022年，8月28日特点：不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。可调节流量。很适用于梯度洗提。不足之处是输出有脉冲波动。第六十八页，共八十八页，2022年，8月28日气动放大泵（pneumatiopressureintensifier）特点：不适用于频繁更换流动相的选择合适溶剂的试验，也不便于梯度洗提（需要用两台泵）。但它能供给无脉冲的、稳定流量的输出。

第六十九页，共八十八页，2022年，8月28日3.6.3洗脱方式

等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵）

适于分析极性差别较大的复杂组分

类似GC的程序升温（沸程较长样品）第七十页，共八十八页，2022年，8月28日第七十一页，共八十八页，2022年，8月28日第七十二页，共八十八页，2022年，8月28日3.6.4进样装置

注射器隔膜进样高分子有机硅胶垫→进样室注射器隔断式停流进样

优点：可以任意改变进样体积，注射快速，不易造成峰扩张缺点：无法测定保留时间，重现性较差，试液容易渗漏GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）第七十三页，共八十八页，2022年，8月28日高压定量进样阀：六通进样阀第七十四页，共八十八页，2022年，8月28日开始分析废液样品

淋洗液至分离柱进样阀样品装样废液

淋洗液至分离柱定量环进样（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）样品环第七十五页，共八十八页，2022年，8月28日高压定量进样阀：

优点：不必停泵，进样量的可变范围大，耐高压，易于自动化

缺点：容易造成色谱峰扩张第七十六页，共八十八页，2022年，8月28日3.6.5色谱柱

常用内壁抛光过的不锈钢制成标准柱型：内径为4.6mm或3.9mm，长为15cm~30cm的直形不锈钢柱。液相色谱填充柱的填充方法：干法和湿法两种颗粒直径大于20μm的可用干法填充颗粒直径10μm以下的采用湿法装柱湿法装柱柱效可达3万塔板/米第七十七页，共八十八页，2022年，8月28日3.6.6检测器

示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）原理：利用折光率的差别进行检测，是通用型检测器缺点：灵敏度低，温度要求严格通用性检测器第七十八页，共八十八页，20