第三章DNA测序技术

第三章DNA测序技术第一页，共四十页，2022年，8月28日20世纪人类科技发展史上的三大创举

90年代人类基因组计划40年代曼哈顿原子弹计划60年代阿波罗登月计划第二页，共四十页，2022年，8月28日人类基因组计划

人类基因组计划（Humangenomeproject）于1990年启动，我国于1999年加入该计划，承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30Mb的测序任务。美国担了54%，其次是英国，承担了33%，日本为7%，法国为2.8%，德国为2.2%。

第三页，共四十页，2022年，8月28日二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成第四页，共四十页，2022年，8月28日2000年6月公共领域测序计划工作框架图第五页，共四十页，2022年，8月28日2002.112004.12水稻和鸡基因组第六页，共四十页，2022年，8月28日华大基因于2007年10月完成了第一个中国人的高质量基因组图谱——“炎黄一号”2008年1月12日由中国、英国和美国的科学家在深圳、伦敦和华盛顿同时宣布国际“千人基因组计划”正式启动。最终目标是获得欧、亚、美、非各洲不同人群中2500人的基因数据。

人基因组第七页，共四十页，2022年，8月28日大熊猫基因组-2010.1“大熊猫基因组”项目于2008年3月启动。研究表明，大熊猫有21对染色体，基因2万多个。第八页，共四十页，2022年，8月28日

破解古人类基因组-2010.2

“萨卡克(Saqqaq)”的人类群体，约在4750年前至2500年前居住于格陵兰岛，其后灭绝。Saqqaq古人的遗传信息比公认的美洲原住民(主要是印第安人和因纽特人，同属黄种人)更加接近于现代东亚和西伯利亚人群。第九页，共四十页，2022年，8月28日人体肠道菌群元基因组-2010.3

收集了124个来自于欧洲人肠道菌群的样本,这个基因集中包含了绝大部分目前已知的人体肠道微生物基因,但更多的是目前未知微生物的基因。从这个基因集中可以估计人肠道中存在约1000到1150种细菌,平均每个体内约含有160种优势菌种,并且这些细菌是绝大部分个体所共有的。

第十页，共四十页，2022年，8月28日2009年4月启动了“世界三极动物基因组计划”2009年8月启动了“万种微生物基因组计划”。2010年1月启动了“1000种动植物基因组计划”，计划未来两年内为一千种重要动植物进行测序，并从科学界征集测序物种的提案。

第十一页，共四十页，2022年，8月28日（一）化学裂解法

(Maxam＆Gilbert,1977)（二）双脱氧链末端终止法

(Sanger,1977)（三）DNA自动化序列分析解读生命的天书-DNA测序第十二页，共四十页，2022年，8月28日

DNA测序技术基础：

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高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）技术

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PAGE能分离长度为300-500个碱基,差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。

第十三页，共四十页，2022年，8月28日核酸序列分析的基本原理化学降解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)第十四页，共四十页，2022年，8月28日一、化学降解法测序的原理1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C4个反应体系3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列第十五页，共四十页，2022年，8月28日碱基特异性修饰及裂解反应体系碱基修饰试剂碱基修饰反应主链断裂试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶C第十六页，共四十页，2022年，8月28日

化学降解G反应模式图硫酸二甲酯哌啶MetMetMetMet第十七页，共四十页，2022年，8月28日化学降解法基本步骤

(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列.

第十八页，共四十页，2022年，8月28日第十九页，共四十页，2022年，8月28日CT+CG+AATTGTCAGGAC试试看第二十页，共四十页，2022年，8月28日二、双脱氧链终止法（Sanger法）原理

DNA链中的戊糖在3’位碳原子上有-OH基团，在

DNA合成、链的延长过程中，新掺入的脱氧核苷酸5’-p与前一核苷酸的戊糖3’-OH以磷酸二酯键相连。

第二十一页，共四十页，2022年，8月28日Sanger法是在反应体系中加入2’,3’-ddNTP，由于其没有3’-OH而不能与下一个核苷酸相连，于是DNA链的合成便终止。第二十二页，共四十页，2022年，8月28日在PCR时加入标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相应于4种碱基）ddX的两个作用：可以当作正常碱基参与复制一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接电泳谁终止，碱基就是谁此方法获1980年的Nobel奖Sanger法：第二十三页，共四十页，2022年，8月28日第二十四页，共四十页，2022年，8月28日第二十五页，共四十页，2022年，8月28日5’3’5’AGCTATCAGCGAAT双脱氧链终止法DNA序列分析原理示意图第二十六页，共四十页，2022年，8月28日序列识读自下而上，5’3’所读序列为模板的互补链第二十七页，共四十页，2022年，8月28日三、DNA测序自动化和大规模测序特点:原理同sanger法标记物为荧光染料（与双脱氧核苷三磷酸共价相连)激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高测序速度快第二十八页，共四十页，2022年，8月28日DNA自动测序步骤：

4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPsSanger测序反应反应产物毛细管电泳分离激光激发、荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。第二十九页，共四十页，2022年，8月28日第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快第三十页，共四十页，2022年，8月28日第二步：荧光检测第三十一页，共四十页，2022年，8月28日DNA自动测序与手工测序的不同点1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑第三十二页，共四十页，2022年，8月28日第三十三页，共四十页，2022年，8月28日第三十四页，共四十页，2022年，8月28日第三十五页，共四十页，2022年，8月28日序列图谱第三十六页，共四十页，2022年，8月28日第三十七页，共四十页，2022年，8月28日第三十八页，共四十页，2022年，8月28日全自动的测序仪器：MegaBac