第三章蛋白质第三节蛋白质结构

第三章蛋白质第三节蛋白质结构第一页，共五十九页，2022年，8月28日

第三节蛋白质的结构一、蛋白质的一级结构二、蛋白质的二级结构三、蛋白质的三级结构四、蛋白质的四级结构第二页，共五十九页，2022年，8月28日蛋白质的结构一级结构：肽链中氨基酸的排列顺序；二级结构：多肽链本身的折叠方式；三级结构：螺旋肽链结构盘绕、折叠成复杂的空间结构；四级结构：蛋白质亚基聚合成大分子蛋白质的方式；蛋白质的结构层次：一级结构→二级结构→超二级结构→结构域→三级结构→四级结构第三页，共五十九页，2022年，8月28日一、蛋白质的一级结构第四页，共五十九页，2022年，8月28日一、蛋白质的一级结构1、肽的一般概念肽：是一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸分子的α-氨基之间脱去一分子水而通过肽键连接成的化合物。肽键：一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸分子的α-氨基缩合是区水而形成的酰胺键。R1R2R3R4RnH2NCHCONHCHCONHCHCONHCHCO………NHCHCOOH肽链，氨基酸残基,主链，侧链N—末端：含有自由氨基的一端，书写用H表示；C—末端：含有自由羧基的一端，书写用OH表示；第五页，共五十九页，2022年，8月28日一、蛋白质的一级结构1、肽的一般概念二硫键：是由二个半胱氨酸残基的侧链之间形成的。即胱氨酸的残基中的二硫键二硫键类型：可以使两条单独的肽链共价交联起来（链间二硫键）；也可以使一条链的某一部分形成环（链内二硫键）第六页，共五十九页，2022年，8月28日一、蛋白质的一级结构1、肽的一般概念链间二硫键NHCHCONHCHCONHCHCOR1R2CH2SSCH2NHCHCONHCHCONHCHCOR3R4二硫键HSCH2CHCOO－NH3+半胱氨酸第七页，共五十九页，2022年，8月28日一、蛋白质的一级结构1、肽的一般概念链内二硫键第八页，共五十九页，2022年，8月28日Page92：图3-8第九页，共五十九页，2022年，8月28日2、肽的命名及表达式例如：H.Tyr.Gly.Gly.Phe.Met.OH（甲硫氨酸型脑啡肽）（1）用结构式来表示，占空间大；（2）用氨基酸中文名称的字头表示；（3）用氨基酸英文名称的三字符或单字符表示；（4）二肽，三肽，多肽第十页，共五十九页，2022年，8月28日3、蛋白质的氨基酸序列和功能（1）蛋白质的一级结构决定了高级结构和功能。（page94图3-11）（2）蛋白质的一级结构与生物的进化有关。同源蛋白质的保守序列反映了物种之间的进化上的距离。（3）一级结构的局部断裂与蛋白质的活性激活有关。例如酶原的激活。（4）蛋白质的一级结构的改变与分子病。例如镰刀状细胞贫血病（血红蛋白β-亚基N-末端第六位Glu→Val）.第十一页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定

世界上第一个氨基酸序列的测定是，1953年由Sanger完成，他用10年的时间测定了含有51个氨基酸残基的牛胰岛素。我国1965年在世界上第一个用化学方法人工合成的蛋白质就是这种牛胰岛素。第十二页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定测定蛋白质一级结构的要求:1.样品必需纯（>97%以上）。2.知道蛋白质的分子量。3.知道蛋白质由几个亚基组成。4.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。5.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。第十三页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定Sanger法氨基酸序列测定的大体步骤为：（一）蛋白质亚基数目的确定及其拆分（二）多肽链的局部断裂和肽段的分离（三）各个肽段氨基酸序列的测定（四）氨基酸完整序列的拼接（五）多肽链中二硫键位置的确定第十四页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定（一）蛋白质亚基数目的确定及其拆分1、蛋白质分子中亚基数目的确定2、蛋白质分子中亚基的拆分3、多肽链的氨基酸组成测定4、多肽链的N-末端和C-末端分析第十五页，共五十九页，2022年，8月28日4、蛋白质一级结构的测定N-末端分析：（1）二硝基氟苯法（FDNB法）：（2）丹磺酰氯法（DNS法）：（3）苯异硫氰酸酯法（PITC法）：（4）氨肽酶法C-末端分析：（1）肼解法：（2）还原法：（3）羧肽酶法：多肽链的N-末端和C-末端分析方法第十六页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定N-末端分析：（1）二硝基氟苯法（FDNB法）：Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。第十七页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定N-末端分析：（2）丹磺酰氯法（DNS法）：在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。第十八页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定N-末端分析：（3）苯异硫氰酸酯法（PITC法、Edman降解法）：用途：此法最大优点是除去N末端氨基酸后剩下的肽链部分仍是完整的。因此，可以用来一步步地测定多肽链N末端的氨基酸顺序。弱碱AAPITC+多肽蛋白AAPTC—多肽蛋白HFPTH-AA+少一个AA的多肽或蛋白异硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰--苯硫乙酰脲H+CH3NO2第十九页，共五十九页，2022年，8月28日4、蛋白质一级结构的测定N-末端分析：（4）氨肽酶法氨肽酶是从胰腺中提取是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。第二十页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定C-末端分析：（1）肼解法：

多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。第二十一页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定C-末端分析：（2）还原法：硼氢化锂还原法(α-羧基反应)RCHCOOHNH－肽LiBH4

还原RCHCH2OHNH－肽α-氨基醇水解RCHCH2OHNH2＋氨基酸混合物第二十二页，共五十九页，2022年，8月28日4、蛋白质一级结构的测定C-末端分析：（3）羧肽酶法：

羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。氨基酸的释放量（摩尔数）反应时间GlySerVal判断序列-Val-Ser-Gly-COOH第二十三页，共五十九页，2022年，8月28日4、蛋白质一级结构的测定（二）多肽链的局部断裂和肽段的分离：多肽链的局部断裂方法主要有酶裂解法和化学裂解法两种，其中酶裂解最常用。酶裂解法：通常是选择专一性很强的蛋白酶来完成的。例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶（专一性看page101）等。多肽链经部分水解后，即降解成长短不一的较小肽段，这些肽段可以应用层析和电泳加以分离和提纯。第二十四页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定（三）各个肽段氨基酸序列的测定：氨基酸肽段序列的分析方法有：1、Edman降解法：2、酶解法：3、气相色谱-质谱联用法：第二十五页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定（四）氨基酸完整序列的拼接肽顺序A1B1A2B2

A3B3

A4Ala.Phe（丙－苯丙）Ala.Phe.Gly.Lys（甘－赖）

Gly.Lys.Asn.Tyr（－天冬酰－酪）

Asn.Tyr.Arg（－精）

Arg.Tyr（－酪）

Tyr.His（－组）（－缬）His.Val十肽顺序Ala.Phe.Gly.Lys.Asn.Tyr.Arg.Tyr.His.Val第二十六页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定（五）多肽链中二硫键位置的确定一般可用蛋白酶或酸直接水解原来的蛋白质，从部分水解产物中分离出含有二硫键的肽段，所得到的肽段混合物可用Brown及Harltay的对角线电泳技术进行分离，确定二硫键位置。确定二硫键位置一般用胃蛋白酶水解原来的含二硫链的蛋白质。因为胃蛋白酶专一性较低，切点多，这样生成的肽段（包括含有二硫桥的肽段）都比较小，后面的分离、鉴定工作均比较容易进行。其次是胃蛋白酶的pH在酸性范围（～2），有利于防止二硫键发生交换反应而造成麻烦。第二十七页，共五十九页，2022年，8月28日

4、蛋白质一级结构的测定（五）多肽链中二硫键位置的确定Brown和Hartlay对角线电泳图解+-+-第二向第一向abpH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段第二十八页，共五十九页，2022年，8月28日二、蛋白质的二级结构(一)维系蛋白质空间结构的化学键盐键氢键疏水键范德华力二硫键配位键(金属离子与蛋白质之间)第二十九页，共五十九页，2022年，8月28日二、蛋白质的二级结构(一)维系蛋白质空间结构的化学键盐键：正负带电基团之间的吸引力所形成的化学键，如NH4+与COO-之间。静电引力较强，但对蛋白质分子三维构象的稳定贡献不是很大，有时也称为离子键。氢键：一个氢原子连接两个电负性强的原子（如氧、氮等）时形成两个键。其中一个为共价键，另一个即为氢键。氢键在α-螺旋和β-折叠中占有极重要的地位，对蛋白质分子三维构象的维护也很重要。第三十页，共五十九页，2022年，8月28日二、蛋白质的二级结构(一)维系蛋白质空间结构的化学键疏水键：是非极性基团为了避开水相而群集在一起的作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构的重要因素。范德华力：是分子间的吸引力，是原子团相互接近时诱导产生的。蛋白质分子的极性基团之间、极性与非极性基团之间、非极性基团之间都存在有这种吸引力，故对维持蛋白质活性中心的构象影响很大。第三十一页，共五十九页，2022年，8月28日二、蛋白质的二级结构(一)维系蛋白质空间结构的化学键二硫键：两个硫原子之间（2个Cys之间）形成的共价键。此键作用很强，可把不同肽链或同一条肽链的不同部分连在一起，对稳定蛋白质构象起重要作用。大多数蛋白质分子由于二硫键的断裂其生物学活性随即丧失。配位键：是一种特殊的共价键，在形成键时两个原子并非各自提供一个共用电子，而是某个原子单方面提供共用电子而形成，结合蛋白质中的金属离子与蛋白质之间的键多为配位键。第三十二页，共五十九页，2022年，8月28日（二）蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构：是指多肽链的主链借助氢键，有规则地卷曲折叠形成沿一维方向具有周期性结构的构象，二级结构与侧链R的构象无关，仅限于主链原子的局部空间排列。维持二级结构稳定的作用力主要是氢键。二、蛋白质的二级结构第三十三页，共五十九页，2022年，8月28日肽单位：肽链中从个α-碳原子到相邻α-碳原子之间的结构称为肽单位，即肽链主链上的重复结构；肽平面：肽键中的六个原子都处在同一个平面上，这一平面称为肽平面，也叫酰胺平面；CαCNCαOH（二）蛋白质的二级结构第三十四页，共五十九页，2022年，8月28日肽单位的三个显著特征（1）肽单位是一个刚性平面结构由于C—N键具有40%双键性质，不能自由旋转，使肽单位的6个原子处于同一平面上（C，C=O，N—H，C）；（2）肽平面中羰基的氧与亚氨基的氢可有顺反两种排布，除pro外，绝大多数为反式（稳定）；

O

－C－N－

H（3）与C相连的两个键为单键，可旋转一定角度；第三十五页，共五十九页，2022年，8月28日蛋白质的二级结构类型-螺旋结构-折叠结构-转角结构无规则卷曲（二）蛋白质的二级结构第三十六页，共五十九页，2022年，8月28日1、-螺旋结构多肽主链环绕一个中心轴有规律的盘绕前进形成的螺旋型构象。（二）蛋白质的二级结构第三十七页，共五十九页，2022年，8月28日1、-螺旋结构α-螺旋结构的特征：（1）形成α-螺旋时，每个氨基酸残基上的Ca的一对二面角φ和ψ°取值是恒定的，φ＝-57°，ψ＝-47°；（2）主链绕中心轴按右手方向盘绕，每上升一圈包含3.6个氨基酸残基，螺距为0.54nm，平均每个氨基酸的残基旋转100°，上升0.15nm；（二）蛋白质的二级结构第三十八页，共五十九页，2022年，8月28日1、-螺旋结构α-螺旋结构的特征：（3）螺旋的稳定性是靠大量氢键来维持的，氢键是由第n个氨基酸残基的C=0(羰基O)与第n+4个氨基酸残基的N-H(亚氨基H)之间形成的，氢键的取向与螺旋的中心轴平行。（二）蛋白质的二级结构第三十九页，共五十九页，2022年，8月28日1、-螺旋结构影响α-螺旋结构稳定性的因素：氨基酸的排列顺序：连续出现同种电荷的氨基酸时α-螺旋结构不稳定；氨基酸的组成：（1）β-碳原子上有分支时不能形成α-螺旋结构：Ile、Val、Thr；（2）特殊氨基酸：Gly、Pro不能形成α-螺旋结构；（二）蛋白质的二级结构第四十页，共五十九页，2022年，8月28日2、-折叠结构

β-折叠：两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链主链上的氨基和羰基之间形成有规则的氢键的折叠片层结构。（二）蛋白质的二级结构Gly、Ala较多出现在β-折叠中。第四十一页，共五十九页，2022年，8月28日2、-折叠结构β-折叠的结构特点：（1）与Ca相连的氨基酸残基的R基交替出现在片层的上方和下方，并且与片层垂直；（二）蛋白质的二级结构第四十二页，共五十九页，2022年，8月28日2、-折叠结构β-折叠的结构特点：（2）β-折叠分为平行式和反平行式两种；（二）蛋白质的二级结构

平行式反平行式所有肽链的N-端都在同一边相邻两条肽链的方向相反第四十三页，共五十九页，2022年，8月28日2、-折叠结构影响β-折叠结构稳定性的因素：（1）氨基酸残基的R基的片大；（2）带有同种电荷的氨基酸残基的连续出现；（二）蛋白质的二级结构第四十四页，共五十九页，2022年，8月28日3、-转角结构

-转角：是球状蛋白质中常见的结构，弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键，形成一个环状结构。（二）蛋白质的二级结构第四十五页，共五十九页，2022年，8月28日3、-转角结构

-转角的结构特点：（1）由连续的4个氨基酸残基组成，其中第一个氨基酸残基的-C=O和第四个残基的–N-H之间形成氢键；（2）主链骨架以180度回折；（3）β-转角的构象是由第二个和第三个氨基酸残基的Ca的二面角所规定；（二）蛋白质的二级结构Asn、Ser、Gly、Pro第四十六页，共五十九页，2022年，8月28日4、无规则卷曲

无规则卷曲：是多肽主链多项随机盘绕所形成的构象，常出现于球状蛋白质中。（二）蛋白质的二级结构α螺旋β折叠β转角自由回转第四十七页，共五十九页，2022年，8月28日(三)蛋白质的超二级结构和结构域1、超二级结构：是指在蛋白质分子中由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互靠近，形成空间上能辨认的有规则的二级结构组合体。(1)、-螺旋构象的聚集体（型）；(2)、-螺旋和-折叠构象的聚集体（型）；(3)、-折叠构象的聚集体（型和c型）；

多数情况下，超二级结构的形成和稳定性取决于非极性氨基端之间的疏水键。第四十八页，共五十九页，2022年，8月28日超二级结构(三)蛋白质的超二级结构和结构域第四十九页，共五十九页，2022年，8月28日2、结构域：

蛋白质形成二级结构和超二级结构的基础上，进一步组合成具有某种功能的结构实体，这种构型称为～。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的结构域缔合而成三级结构。

对于较小的蛋白质分子或亚基来说，结构域和三级结构是一个意思。(三)蛋白质的超二级结构和结构域第五十页，共五十九页，2022年，8月28日结构域(三)蛋白质的超二级结构和结构域第五十一页，共五十九页，2022年，8月28日三、蛋白质的三级结构1、蛋白质的三级结构：球状蛋白质在二级结构、超二级结构及结构域的基础上，再进行三维多向性盘绕形成近似球状的构象称为～。

2、三级结构涉及到主链和侧链所有原子和原子团的空间排布关系，但不涉及亚基间和分子间的排布关系。第五十二页，共五十九页，2022年，8月28日三、蛋白质的三级结构3、蛋白质三级结构的共同特征：（1）通常是由多种二级结构组成；（2）亲水性氨基酸多位于表面，