高三生物一轮复习课件 【知识精讲架构+备课精研精梳】基因工程

[课标要求]1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。第十单元

第6课时

基因工程1.基因工程的概念？操作水平？原理？优点？2.DNA重组技术的三种工具及其作用？3.DNA粗提取的原理？DNA鉴定的原理？4.基因工程的四个步骤？什么是目的基因，举例说明？5.PCR技术全称和原理？PCR技术的条件？目的基因基因重组受体分子遗传性状基因工程基因工程得以实现的理论基础是？拓展基因工程的理论基础苏云金杆菌与载体拼接普通棉花（无抗虫特性）棉花细胞抗虫棉提取表达Bt基因导入Bt基因重组DNA分子基因工程的实现需要解决哪些问题？1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的

检测与鉴定如何筛选和获取？为何要拼接？如何拼接？需要什么工具？将目的基因导入不同生物细胞的方法重组DNA分子需具备哪些条件？目的基因一定能进入受体细胞吗？进入受体细胞后一定能表达吗？工具工具酶分子运输车：

。（１）

。（２）

。限制酶ＤＮＡ连接酶载体【易错警示】工具酶≠工具质粒λ噬菌体的衍生物动植物病毒“手术刀”“缝合针”一、重组DNA技术的基本工具1.限制酶原核生物数千特定核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端一、重组DNA技术的基本工具(1)源于选择性必修3P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。突破：用限制酶切割时需注意的事项①获取目的基因和切割载体时,通常使用同种限制酶,目的是

。但是使用该法缺点是容易发生

，为了避免上述情况发生，可采取的措施是

。②获取一个目的基因需限制酶切割

次,共产生

个游离的磷酸基团。为了产生相同的黏性末端，便于连接两4分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接一、重组DNA技术的基本工具1.限制酶(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。延伸应用图解限制酶的选择原则例1.①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是

。②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是

。SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因确保目的基因与质粒的定向连接例2.如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线

用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是

（从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：

。

BamHⅠ/HindⅢ若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点2.DNA连接酶磷酸二酯键大肠杆菌黏性末端黏性末端分子缝合针一、重组DNA技术的基本工具（1）限制酶与DNA连接酶的关系(如下图)：（2）DNA连接酶与DNA聚合酶的关系(如下图)：相同点——作用位点都在磷酸二酯键不同点——DNA聚合酶DNA连接酶DNA连接酶DNA聚合酶：单个核苷酸与DNA片段DNA连接酶：DNA片段与DNA片段一、重组DNA技术的基本工具环状双链DNA分子噬菌体有一个至多个自我复制受体DNA标记最常用的载体—质粒一、重组DNA技术的基本工具3.载体1.在基因工程中，已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图示判断下列操作错误的是()A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B.用限制酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解C.限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割后获得的黏性末端相同D.质粒中标记基因便于筛选出目的基因已经表达的细胞E.用酶I和酶II形成相同的黏性末端，且用DNA连接酶连接的重组DNA还能用上面两种酶切割DE2.某线性DNA分子含有3000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是()a酶切割产物(bp)b酶再次切割产物(bp)1600；1100；300800；300A.在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个B.a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接C.a酶与b酶切断的化学键不相同D.用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，D序列会明显增多例1.下表为常用的限制性内切核酸酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法中，错误的是（）注：Y为C或T，R为A或G。A.HindⅡ、SmaⅠ两种限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列限制酶名称识别序列和切割位点限制酶名称识别序列和切割位点BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGC目的基因的筛选与获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定二、基因工程的基本操作程序①从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。②利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。1.目的基因的筛选与获取从生物材料获取目的基因生物材料DNARNA一定大小范围的DNAcDNA逆转录基因组文库

cDNA文库基因文库获取目的基因PCR导入受体菌中保存限制酶酶切包括已知序列：人工合成①人工合成目的基因②用PCR特异性地快速扩增目的基因NCBIGeneBankBLAST二、基因工程的基本操作程序提取苏云金芽孢杆菌抗虫基因？快速获得大量抗虫基因②利用PCR获取和扩增目的基因结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？PCR——聚合酶链式反应PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物（2种）稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）四种脱氧核苷酸dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶基本过程变性

复性

延伸

条件P77引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸②利用PCR获取和扩增目的基因二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取DNA模板Step1：加热至90℃以上使双链分开Step2:冷却至50℃左右使引物与DNA结合引物Step3:DNA合成+DNA聚合酶+dATP+dGTP+dCTP+dTTP第一轮的产物①变性90℃以上②复性③延伸冷却加热50℃左右引物模板结合72℃左右DNA从5’端到3’端延伸。72℃时，二、基因工程的基本操作程序1.目的基因的筛选与获取易错提醒PCR扩增过程中的循环图示与规律需要引物的原因？DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。①1个模板DNA分子经过n轮PCR，可以扩增出

个DNA片段，共需要引物数量为

。②1个模板DNA分子经过

轮PCR，可以扩增出仅含引物之间的片段。2n2n＋1－236.利用重叠延伸PCR技术进行定点突变可以实现对纤维素酶基因进行合理性改造，其过程如下图所示。下列分析不正确的是A.PCR1过程中的产物AB是依赖引物a和引

物b扩增的结果B.引物c和引物b上均含有与模板链不能互

补的碱基C.①过程需要先加热至90℃以上后再冷却

至50℃左右D.②过程需要利用引物a和引物d获得突变

产物ADD2.(2020·北京，12)为了对重金属污染的土壤进行生物修复，研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白(HMA3)基因与外源高效启动子连接，导入杨树基因组中(如图)。为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因，同时避免内源HMA3基因的干扰，在进行PCR扩增时，应选择的引物组合是A.①＋③

B.①＋②C.③＋②

D.③＋④B(1)基因表达载体的目的①使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成位置：功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。基因的首端（一段有特殊结构的DNA片段）人们所需要的基因位置：功能：基因的尾端（一段特殊的DNA片断）终止mRNA的转录用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞2.基因表达载体的构建二、基因工程的基本操作程序(3)基因表达载体的构建过程基因表达载体构建模式图2.基因表达载体的构建二、基因工程的基本操作程序单酶切缺点?A.目的基因自身环化B.质粒重新环化C.质粒与目的基因反向连接如何解决这一问题？双酶切将目的基因导入受体细胞的方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创3.将目的基因导入受体细胞转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。二、基因工程的基本操作程序(1)花粉管通道法②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；花粉管通道法导入外源DNA3.将目的基因导入受体细胞(植物)二、基因工程的基本操作程序(2)农杆菌转化法示意图Ti质粒目的基因构建基因表达载体含目的基因的重组Ti质粒转入农杆菌导入植物细胞目的基因插入染色体DNA中植物细胞表现出新性状的植株植物组织培养3.将目的基因导入受体细胞(植物)二、基因工程的基本操作程序显微注射法操作程序：取受精卵显微注射胚胎移植为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？提纯基因表达载体①体积大，易操作。②全能性高，易培养成完整个体。3.将目的基因导入受体细胞(动物)二、基因工程的基本操作程序使用Ca2+处理：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。过程微生物作为受体细胞的优点：繁殖快，单细胞，遗传物质相对较少，易于培养操作Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子大肠杆菌细胞原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。3.将目的基因导入受体细胞(微生物)二、基因工程的基本操作程序类型步骤检测内容方法分子检测第一步转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因PCR等技术第二步目的基因是否转录出mRNAPCR等技术第三步目的基因是否翻译形成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体水平鉴定抗虫或抗病的接种实验抗性以及抗性程度

抗性检测；基因工程产品与天然产品的功能活性比较

功能活性。4.目的基因的检测与鉴定二、基因工程的基本操作程序玉米是二倍体植物，某科研人员将BT毒蛋白基因导入玉米细胞，培育转基因抗虫玉米，实验流程图如下，EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ为限制酶（箭头所指为酶切位点）。回答下列问题（1）过程①构建重组质粒时，为使BT毒蛋白基因与质粒定向拼接，应选用_____________（填

限制酶名称）切割BT毒蛋白基因与质粒，不选另一种限制酶因为

_____________________

图中质粒没有标明的结构是___________，该结构的作用是_____________________。（2）过程②常用农杆菌转化法将重组质粒导入愈伤组织，该方法能够借助Ti质粒上的_______

将BT毒蛋白基因整合到愈伤组织的________________________。

EcoRⅠ、BamHⅠ

限制酶SmaⅠ会破坏目的基因

标记基因

筛选含有目的基因的细胞

T—DNA

染色体DNA紫花苜蓿是一种重要的牧草。某研究团队拟将耐盐基因HAL1导入紫花苜蓿中培育耐盐牧草。具体实验流程如图所示。下列操作错误的是

(

)A．可选用氯化钙处理农杆菌，有利于重组Ti质粒导入农杆菌B．将农杆菌与苜蓿愈伤组织一起培养一段时间后，往往需要添加适量抗生素抑制农杆菌生长C．为确认转基因苜蓿是否培育成功，需对苜蓿植株进行耐盐检测D．植物细胞具有全能性，所以诱导形成苜蓿幼苗的成功率与苜蓿愈伤组织的基因型无关D7.(2022·云南高三联考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面，构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术，在大肠杆菌中表达pORF2，制备戊型肝炎疫苗，过程如图。下列关于该疫苗的叙述，正确的是A.过程①需要的酶是RNA聚合酶，原料是

A、U、G、CB.重组基因表达载体上的启动子需来源于戊型肝炎病毒C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中

DNA分子的生理状态D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定D2.实验原理：（1）DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。（2）DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/LNaCl溶液。（3）在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。00.14NaCI浓度（mol/L）DNA溶解度1.实验设计思路：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法去除其他成分，对DNA进行提取。三、DNA的粗提取与鉴定

DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。

不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。3.选材：注意：4.试剂：①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂⑤蒸馏水——含有NaCl、EDTA、SDS、Tris和HCl——析出DNA——溶解DNA——鉴定DNA，要现配现用三、DNA的粗提取与鉴定冷酒精析出DNADNA的鉴定（沸水浴、二苯胺）研磨称取约30g洋葱切碎，放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。纱布过滤取上清液在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；取两支试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。然后，向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。三、DNA的粗提取与鉴定①以血液为实验材料时，每100mL血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。②利用动物细胞提取DNA破碎细胞的方法：动物细胞无细胞壁，可直接吸水涨破。③加入研磨液后，必须充分研磨，否则细胞核不会充分破碎，释放出的DNA量就会减少。④加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。⑤预冷的酒精具有以下优点：a.可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；b.抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出；c.低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少其断裂。三、DNA的粗提取与鉴定注意事项1.DNA体外扩增的原理PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。2.DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。四、DNA片段的扩增及电泳鉴定用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。循环程序变性复性延伸预变性940C，5min30次940C,30s550C,30s720C，1min最后一次940C，1min550C,30s720C，1min移液离心扩增四、DNA片段的扩增及电泳鉴定3.PCR实验操作步骤根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。配制琼脂糖溶液制备凝胶加样电泳、观察接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。四、DNA片段的扩增及电泳鉴定4.DNA的电泳鉴定1．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是()

A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取

B．植物材料需先研磨破碎细胞

C．DNA只能溶于2mol/L的NaCl溶液

D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后，颜色呈紫色B2．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是()

A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B．PCR利用了DNA的热变性原理

C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换C乳腺（房）生物反应器器官移植生长五、基因工程的应用（1）乳房（乳腺）生物反应器：

①具体做法：将

基因与