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第三节核酸序列测定--sanger双脱氧链终止法物种的本质特征DNA的一级结构生物界丰富多样性DNA序列的多样性核酸序列测定DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。

Sanger和胰岛素模型

Sanger和核酸模型目前应用最广泛的是：Sanger双脱氧链终止法。Maxam-GilbertDNA化学降解法。新技术：杂交测序法，质谱法，单分子测序法，原子探针显微镜测序法，DNA芯片法。2023/2/15安徽农业大学生命科学学院5DNA复制的4个基本条件：1、模板SSDNA(single-stranded单链DNA)2、聚合酶3、带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物4、4种dNTP核酸的序列测定双脱氧链终止法的链终止剂（chain-reminator）-2，3-二脱氧核糖核苷酸（ddNTP）当3’-0H由于脱氧或被取代,下一个核苷酸不形成3’、5’磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果相同的4组引物模板混合物,每一组加4种dNTP，其中1种用32P(或35S)标记，加1种ddNTP，每组将产生一种特异性的以ddNTP为末端的不同长度的核苷酸链,经聚丙烯酰胺凝胶（即PAGE胶）分离，即可读出被测定的全部顺序。(一)模板纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA都可以用作Sanger法测定的模板。通常采用M13噬菌体颗粒分离到的单链DNA模板效果最好。DNA序列测定模板制备方法以300-500bp较好,300bp最佳2种限制酶消化待测DNA如果超过700-800bp,则进行第二次限制酶消化（二）聚合酶聚合酶可以根据测序的不同要求选用以下三种。1.聚合酶

Klenow大片段2、测序酶(

Sequenase)3、

TaqDNA聚合酶（三）带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物M13噬菌体重组的通用测序引物一般长15-29bp。双脱氧链终止法进行DNA序列测定的工作原理ddNTP是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs（一般1：3~4）。2023/2/1515南京农业大学生命科学学院2023/2/1517在自动测序中将荧光素连在4种ddNTP上测序模板的纯化与定量测序反应—PCR仪测序反应产物纯化与变性上样电泳—测序仪分析结果2023/2/15182023/2/15

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