灭菌与空气的净化

灭菌与空气的净化第一页，共七十七页，2022年，8月28日灭菌的基本原理培养基和发酵设备的灭菌空气的除菌本章主要内容第二页，共七十七页，2022年，8月28日第一节灭菌的基本原理一.灭菌的原理和方法灭菌(disinfection)

：用物理或化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。消毒(sterilization)

：用物理或化学的方法杀灭物料、容器、器具内外的病原微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死孢子。无菌(asepsis)：不存在活菌，多是灭菌的结果。第三页，共七十七页，2022年，8月28日工程上灭菌：是指使用物理或化学方法将培养基及发酵设备中的杂菌的细胞和孢子杀灭至不影响发酵为限。

灭菌是为了保证进行纯培养（纯种）发酵。

第四页，共七十七页，2022年，8月28日消毒灭菌的方法

（一）物理消毒灭菌法（二）化学消毒法

第五页，共七十七页，2022年，8月28日（一）物理消毒灭菌法

1.热力灭菌法

热力灭菌法分干热灭菌和湿热灭菌两大类。在同一温度下，后者效力比前者为大，这是因为：（1）湿热中细菌菌体蛋白较易凝固；（2）湿热的穿透力比干热大；（3）湿热的蒸汽有潜热存在。水由气态变为液态时释放出的潜热，可迅速提高被灭菌物体的温度。第六页，共七十七页，2022年，8月28日湿热灭菌法1.煮沸法：1个大气压下，煮沸的水温为100℃，一般细菌繁殖体煮沸5分钟即被杀死。细菌芽孢常需煮沸1～２小时，才被杀死。水中加入2%碳酸钠，既可提高沸点达105℃，促进细菌芽胞的杀灭，又可防止金属器皿生锈。

2.巴氏消毒法（pasteurization）:用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热61.1～62.8℃半小时即可，常用于牛奶和酒类等的消毒。

第七页，共七十七页，2022年，8月28日3.间歇灭菌法（fractionalsterilization）:是利用反复多次的流通蒸汽加热，杀死细菌所有繁殖体和芽胞的灭菌法。具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺流通蒸汽灭菌器内，100℃加热15～30分钟，杀死其中的细菌繁殖体，然后将物品置于37℃温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体，次日再通过流通蒸汽加热，如此连续三次，可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。4.高压蒸汽灭菌法：是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅—高压蒸汽灭菌器内进行的。加热时蒸汽不能外溢，容器内温度随蒸汽压的增加而升高，杀菌力也大为增强。通常在1.05kg/cm2的压力下，温度达121.3℃,维持15～30分钟，可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌。第八页，共七十七页，2022年，8月28日第九页，共七十七页，2022年，8月28日灭菌锅湿热灭菌使用的设备第十页，共七十七页，2022年，8月28日第十一页，共七十七页，2022年，8月28日2.紫外线与射线灭菌法1.紫外线：紫外线的杀菌作用与其波长有关，通常紫外线波长为240～280nm时具有杀菌作用，其中以260nm最强。

2.电离辐射：高速电子、X射线和γ射线等在足够剂量时，对各种细菌均有致死作用。电离辐射常用于大量一次性医用塑料制品的消毒。

第十二页，共七十七页，2022年，8月28日第十三页，共七十七页，2022年，8月28日第十四页，共七十七页，2022年，8月28日3.过滤除菌过滤除菌是用物理阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，以达到无菌的目的。过滤除菌主要用于一些不耐高温灭菌的血清、细菌毒素、抗生素，以及空气等的除菌。滤菌器的种类很多，目前常用的有滤膜滤菌器、石棉滤菌器（亦称Seitz滤菌器）、玻璃滤菌器等。第十五页，共七十七页，2022年，8月28日第十六页，共七十七页，2022年，8月28日第十七页，共七十七页，2022年，8月28日（二）化学消毒法用化学药品进行消毒的方法，由于化学药品对细菌及人体都有毒性，故只能用于体表、医疗器械及周围环境等的消毒。杀菌机制：（1）使菌体蛋白质变性或凝固；（2）干扰细菌的酶系统和代谢；（3）影响细菌胞浆膜的通透性。第十八页，共七十七页，2022年，8月28日消毒剂类别名称浓度(%)用途重金属盐红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化剂高锰酸钾0.1皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类碘液2.5皮肤消毒醇类乙醇70～75皮肤、体温计消毒酚类石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒来苏3～5同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性剂新洁尔灭0.1手术器械消毒酸碱类生石灰1:4～1:8排泄物、地面消毒染料龙胆紫2～4表浅创伤消毒第十九页，共七十七页，2022年，8月28日二.湿热灭菌的原理及影响因素1.湿热灭菌的原理湿热灭菌：就是直接用高温蒸汽灭菌。蒸汽在冷凝时释放出大量潜能，蒸汽具有强大穿透力，蒸汽的湿热破坏菌体蛋白质和核酸的化学键，使酶失活，微生物因代谢障而死亡。第二十页，共七十七页，2022年，8月28日致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。热阻：表示微生物对热的抵抗能力，指微生物在某一条件下（主要是温度）的致死时间。

芽孢的热阻特别高。概念：第二十一页，共七十七页，2022年，8月28日枯草芽孢体第二十二页，共七十七页，2022年，8月28日2.微生物的热死规律——对数残留定律微生物热死：微生物受热失活直到死亡。微生物受热死亡主要是由于微生物细胞内酶蛋白受热凝固，丧失活力所致。对数残留定律：湿热灭菌时，培养基中微生物受热死亡（个数减少）的速度与残有的微生物数量成正比。-dN/dt=kN；N：培养基中微生物的个数，t：时间，k：比死亡速率。从0t，N0Nt积分上式可得：t=2.303kLgN0Nt第二十三页，共七十七页，2022年，8月28日随时间的延长，加热灭菌的残存菌数呈对数减少，且温度越高，死亡越快。灭菌时间取决于污染的程度（N0），灭菌的程度（残留菌数Nt）和k值。K值：微生物耐热性的一种特征，随微生物种类和

灭菌温度而异。温度相同，k值越小，微生物愈耐热。对于同一微生物，灭菌温度越低，k值愈小。提高灭菌温度，k值增大，灭菌时间缩短。第二十四页，共七十七页，2022年，8月28日通常必要的灭菌条件是110～130℃，5～20min。芽孢对热耐受强，并不始终符合对数残留定律。培养液灭菌多采用高温短时间加热的方式。一般以芽孢细菌和细菌芽孢的数量合作为依据来计算灭菌时间。在实际操作中，要达到Nt＝0，即t为∞，是不可能的，因此，在设计时常采用

Nt＝0.001。第二十五页，共七十七页，2022年，8月28日一、培养基灭菌温度的选择培养基灭菌的过程中，除微生物被杀死，营养成分也遭到破坏；高压加热情况下，氨基酸、维生素极易被破坏。因此必须选择一个能达到灭菌的目的又能使培养基中营养成分破坏至最小的灭菌工艺条件。第二节培养基和发酵设备的灭菌第二十六页，共七十七页，2022年，8月28日动力学分析1.培养基的破坏反应动力学大部分的培养基的破坏为一级分解反应，动力学方程如下

dc/dt=-k'cc－反应物的浓度，mol/L;t－反应时间，min；k'－化学反应速率常数（随温度及反应类型而变），min-1

用阿伦尼乌斯方程表示

k'＝A'e-E'/RTA‘－频率因子；E'－反应所需的活化能J/mol；R－气体常数，8.314J/mol*KT－绝对温度，K第二十七页，共七十七页，2022年，8月28日2.杂菌的死亡动力学杂菌的死亡也属于为一级动力学类型，动力学方程如下

dN/dt=-kN

用阿伦尼乌斯方程表示

k＝Ae-E/RTA－频率因子；E－杀死微生物所需的活化能，J/mol；R－气体常数，8.314J/mol*KT－绝对温度，K第二十八页，共七十七页，2022年，8月28日在灭菌时，温度由T1升高到T2，灭菌速率常数k和培养基成分破坏速率常数k'的值为：

k1=Ae-E/RT1

ln(k2/k1)=E/R(1/T1-1/T2)(1)

k2=Ae-E/RT2

k'1=A’e-E’/RT1

ln(k'2/k'1)=E/R(1/T1-1/T2)(2)

k'2=A’e-E’/RT2ln(k2/k1)E(1)/(2)=>1ln(k'2/k'1)E’灭菌时活化能E大于培养基营养成分破坏的活化能E’第二十九页，共七十七页，2022年，8月28日所以，随温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分分解的速率常数的增加

灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高超过了培养基营养成分破坏的速度

温度升高时，微生物死亡的速度更快因此，采用高温瞬时灭菌法较好ln(k2/k1)ln(k'2/k'1)>1第三十页，共七十七页，2022年，8月28日1.分批灭菌指将配制好的培养基放入发酵罐中，直接用蒸汽加热，达到灭菌要求的温度和压力后维持一定时间，再冷却至发酵要求的温度，也称实罐灭菌。二、培养基的灭菌方法第三十一页，共七十七页，2022年，8月28日Ⅰ.升温阶段

升温方式：在夹套和蛇管中通入蒸汽间接加热；在培养基中直接通入蒸汽加热。培养基温度不太高时，相应k值非常小，灭菌效果可以忽略不计，因此，在升温阶段可以认为只有在温度高于100℃时才有灭菌作用。Ⅱ.保温阶段

灭菌的主要时段，习惯上把保温时间看作灭菌时间。此时，k值不变，培养基温度恒定，则保温时间为：

t=2.303/k×lg(N1/N2)第三十二页，共七十七页，2022年，8月28日Ⅲ.冷却阶段培养基灭菌后用冷却水间壁将培养基冷却至培养所要求温度的过程。第三十三页，共七十七页，2022年，8月28日第三十四页，共七十七页，2022年，8月28日2.连续灭菌培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程，也称“连消”。第三十五页，共七十七页，2022年，8月28日连续灭菌的方法（1）喷射加热连续灭菌（2）薄板换热器连续灭菌（最先进的灭菌方式）（3）喷淋冷却连续灭菌（最基础的灭菌方式）第三十六页，共七十七页，2022年，8月28日喷射加热连续灭菌第三十七页，共七十七页，2022年，8月28日典型的喷射加热连续灭菌时的温度和时间曲线图第三十八页，共七十七页，2022年，8月28日薄板换热器连续灭菌第三十九页，共七十七页，2022年，8月28日薄板换热器连续灭菌时的温度和时间曲线图第四十页，共七十七页，2022年，8月28日第四十一页，共七十七页，2022年，8月28日3.固体培养基灭菌利用转鼓式灭菌机，装料后旋紧进出口盖，旋转转鼓使培养基得到翻动，蒸汽沿轴中心通过加热培养基达到一定温度后，进行保温灭菌。灭菌完毕后用真空泵沿空心横抽真空，转鼓内压力降低，培养基冷却。第四十二页，共七十七页，2022年，8月28日4.补料液的灭菌灭菌的方法则视料液的性质、体积和补料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属设备和管道都要经过灭菌。第四十三页，共七十七页，2022年，8月28日三.影响培养基灭菌的因素

培养基成分：油脂、糖类及蛋白质的浓度越大，灭菌的温度越高；低浓度（1％～2％）的Nacl溶液对微生物的耐热性有保护作用，而浓度达8％～10％以上，则减弱微生物的耐热性

pH：培养基的pH越低，灭菌时间越短培养基中颗粒：颗粒越小，灭菌越容易泡沫：培养基形成泡沫对灭菌不利第四十四页，共七十七页，2022年，8月28日四.培养基灭菌时间的计算第四十五页，共七十七页，2022年，8月28日培养基分批灭菌时间的计算例.有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败几率为0.001时所需要的灭菌时间。假设不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中所有的菌均看作是保温阶段被杀灭第四十六页，共七十七页，2022年，8月28日可简单的利用t=2.303/k×lg(N1/N2)粗略地计算灭菌所需要的时间。解：N1=40×106×2×105=8×1012

N2=0.001，K=1.8min-1

灭菌时间:t=2.303/k×lg(N1/N2)=2.303/1.8lg(8×1015)=31.5min题解第四十七页，共七十七页，2022年，8月28日培养基连续灭菌时间的计算培养基中的含菌数以1mL培养基的含菌数来计算，计算公式如下：

t=2.303/klg(c0/ct)C0－单位体积培养基灭菌前的含菌个数，个/mLCt－单位体积培养基灭菌后的含菌个数，个/mL第四十八页，共七十七页，2022年，8月28日例题有一发酵罐内装40m3培养基，在131℃温度下进行连续灭菌。原污染程度为每1mL有2×105个耐热细菌芽孢，131℃时灭菌速度常数为1.5min-1。求灭菌失败几率为0.001时灭菌所需要的维持时间。第四十九页，共七十七页，2022年，8月28日题解t=2.303/klg(c0/ct)C0＝2×105（个/mL)k＝1.5min-1ct

＝1/（40×106×103）＝2.5×10-11（个/mL）t=2.303/k×lg(c0/ct)＝24.4（min）第五十页，共七十七页，2022年，8月28日五、分批灭菌和连续灭菌的比较连续灭菌优点：可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率发酵罐利用率高；蒸汽负荷均衡采用板式换热器时可节约大量能源适宜采用自动控制，劳动强度小适用于大规模生产缺点：不适合用于粘度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加了染菌的几率。第五十一页，共七十七页，2022年，8月28日分批灭菌优点：－设备投资较少不需要其他附属设备

–染菌的危险性较小

–人工操作较方便

–对培养基中固体物质含量较多时更为适宜；缺点：加热和冷却的时间较长，营养成分有一定的损失；罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺；只适用于中小型发酵罐。第五十二页，共七十七页，2022年，8月28日六、发酵设备的灭菌设备灭菌条件杀菌锅内灭菌蒸汽压力0.098MPa，固体培养基灭菌维持20～30min；液体培养基维持15～20min；玻璃器皿及用具灭菌，维持30～60min种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌蒸汽压力0.147MPa，45min空气总过滤器和分过滤器灭菌蒸汽压力0.174MPa，灭菌2h，灭菌完毕，通入压缩空气吹干种子罐实罐灭菌、发酵培养基实罐灭菌、消泡剂灭菌温度121℃，30min发酵培养基连续灭菌温度135℃，5min补料实罐灭菌温度121℃，5min尿素溶液灭菌温度105℃，5min第五十三页，共七十七页，2022年，8月28日习题为什么培养基的灭菌最好采用高温瞬时灭菌法？第五十四页，共七十七页，2022年，8月28日第三节空气的除菌A.空气除菌的方法获取无菌空气的方法由多种，如辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。

工业生产物常用制备无菌空气的方法第五十五页，共七十七页，2022年，8月28日热灭菌法：加热后微生物体内的蛋白质（酶）热变性所致空气进入培养系统前，需压缩，所以就利用空气压缩时所产生的热量进行灭菌。第五十六页，共七十七页，2022年，8月28日2.静电除菌利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘灭菌的目的。悬浮于空气中的微生物，其孢子大多数带有不同的电荷。直径很小的微粒，其所带的电荷很小，所以静电除尘灭菌对很小的微粒效率很低。第五十七页，共七十七页，2022年，8月28日3.介质过滤除菌法：是目前获得大量无菌空气的常规方法让含菌空气通过过滤介质，以阻截空气中所含微生物而获得无菌空气。空气中的微生物大多是细菌和芽孢，还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。这些微生物在空气中极少单独游离存在，基本上是附着于灰尘、液滴等微生物的表面上。介质过滤除菌就是把空气中的各种微生物和极少量的游离生物捕集起来予以除掉。第五十八页，共七十七页，2022年，8月28日空气过滤除菌的介质1.纸类过滤介质：滤纸、玻璃纤维纸（3～6层）优点：过滤效率高，对于大于0.3μm的颗粒的去除效率为99.99％以上，阻力比较小，压降较小。缺点：强度不大，受潮后强度更差，（实际生产中，在纸浆中添加7％～50％的木浆来增加其强度）第五十九页，共七十七页，2022年，8月28日滤纸第六十页，共七十七页，2022年，8月28日显微镜下的滤纸第六十一页，共七十七页，2022年，8月28日玻璃纤维纸第六十二页，共七十七页，2022年，8月28日第六十三页，共七十七页，2022年，8月28日2.纤维状或颗粒状过滤介质棉花玻璃纤维活性炭第六十四页，共七十七页，2022年，8月28日优点：材料不易损坏，取材容易。缺点：对0.3μm以下的颗粒的过滤效率仅为99％，难以满足发酵工业的无菌要求，需多次过滤；体积大，占有空间大，操作困难，装填料介质费时费力，介质装填的松紧程度不易掌握，空气压降大；介质灭菌和吹干耗用大量蒸汽和空气。第六十五页，共七十七页，2022年，8月28日玻璃纤维第六十六页，共七十七页，2022年，8月28日活性炭第六十七页，共七十七页，2022年，8月28日第六十八页，共七十七页，2022年，8月28日3.微孔滤膜类过滤介质特点过滤介质的孔径能小于0.1μm，能将空气中的细菌真正滤去；易于控制过滤后空气的质量；节约能量和时间，操作简便；使用前需预处理，以除去空气中的油和水，以此提高过滤膜的使用寿命。第六十九页，共七十七页，2022年，8月28日微孔滤膜第七十页，共七十七页，2022年，8月28日微孔滤膜第七十一页，共七十七页，2022年，8月28日第七十二页，共七十七页，2022年，8月28日介质