有害成分的测定

有害成分的测定第一页，共六十六页，2022年，8月28日

毒素生物毒素（Biotoxin)是一大类生物活性物质的总称，包括动物毒素、植物毒素和微生物毒素。生物毒素已经对食品安全和人类健康构成了威胁，因此，食品/饲料中生物毒素的研究也日益显现出其必要性和迫切性。第一节食品中内源性毒素的测定第二页，共六十六页，2022年，8月28日毒蘑菇

毒蘑菇所含有的有毒成分可分为生物碱类、肽类及其他化合物，根据中毒的症状可分为胃肠毒素、神经精神毒素、血液毒素、原浆毒素和其他毒素五类。磨菇毒素的检验常用纸层析法或薄层层析法。第三页，共六十六页，2022年，8月28日有毒蕈类（俗称蘑菇）白毒伞豹斑毒伞

块鳞青毒伞角鳞灰伞

灰托柄菇

晶粒鬼伞

在我国目前已经鉴定的蕈类中，可食用的近300多种，有毒的近80多种，剧毒可致死的不到10种。第四页，共六十六页，2022年，8月28日大鹿花菌

分布于我国吉林、西藏等地区。可能有毒，毒性因人而异，不可食用。白毒鹅膏菌

分布于我国河北、吉林、江苏、福建、安徽、陕西、甘肃、湖北、湖南、山西、广西、广东、四川、云南、西藏等地。

此蘑菇极毒。毒素为毒肽和毒伞肽。中毒症状主要以肝损害型为主，死亡率很高。

第五页，共六十六页，2022年，8月28日毒蝇鹅膏菌

分布于我国黑龙江、吉林、四川、西藏、云南等地。

此蘑菇因可以毒杀苍蝇而得名。误食后约6小时以内发病，产生剧烈恶心、呕吐、腹痛、腹泻及精神错乱，出汗、发冷、肌肉抽搐、脉搏减慢、呼吸困难或牙关紧闭，头晕眼花，神志不清等症状。使用阿托品疗效良好。细环柄菇

分布于黑龙江、吉林、山西、江苏、云南、广东、香港、青海、新疆和西藏等地。

可食用，但有人认为有毒，不宜随意采食。

第六页，共六十六页，2022年，8月28日毛头鬼伞

半卵形斑褶菇毒粉褶菌第七页，共六十六页，2022年，8月28日介味滑锈伞

美丽粘草菇

粉红枝瑚菌

第八页，共六十六页，2022年，8月28日海洋藻类毒素海洋藻类毒素是由海洋中的微藻或海洋细菌产生的一类生物活性物质的总称。由于这些毒素通常是通过海洋贝类或鱼类等生物媒介造成人类中毒的，因此这些毒素常被称作贝毒或鱼毒。常见的贝毒有麻痹性贝毒，腹泻性贝毒，记忆缺失性贝毒，神经性贝毒等。我国浙江、福建、广东等地曾多次发生贝类中毒，导致中毒的贝类有蚶子、花蛤、香螺、织纹螺等常食用的贝类。第九页，共六十六页，2022年，8月28日

贝类毒素的检测1、小白鼠生物测定法取稀释的贝类提取液lmL注射到18-22g重的小白鼠腹腔，测定死亡时间，规定15min致死的量为1MU。2、化学检测法在碱性条件下用双氧水氧化PSP使其生成荧光物质，再测其荧光值。3、高压液相色谱法第十页，共六十六页，2022年，8月28日

防止贝类毒素中毒的措施①定期对海水进行监测，及时掌握藻类和贝类的活动情况。当海水中大量存在有毒的藻类时，应同时监测当时捕捞的贝类所含的毒素量。②食用贝类食品时，要反复清洗、浸泡，并采取适当的烹饪方法，以清除或减少食品中的毒素。③制定该类毒素在食品中限量标准。④发现中毒者，应及时采取措施，结合对症治疗，采取催吐、洗胃、导泻等措施，尽早排除体内毒素。第十一页，共六十六页，2022年，8月28日根据中毒症状分类第十二页，共六十六页，2022年，8月28日麻痹性贝毒麻痹性贝毒是分布最广，危害最大的一类毒素。它是由甲藻产生的一类四氢嘌呤毒素的总称。主要症状表现为面部、肢端麻木，严重的会因呼吸肌麻痹而导致死亡。腹泻性贝毒腹泻性贝毒毒素主要来自甲藻中的鳍藻属和原甲藻属。主要症状为呕吐和腹泻，长期毒性效应可能导致癌症。第十三页，共六十六页，2022年，8月28日记忆缺失性贝毒记忆缺失性贝毒的活性成分为软骨藻酸。中毒者表现出肠道症状和神经紊乱，严重的有短暂的记忆丧失现象。神经性贝毒神经性贝毒是到目前为止危害范围较小的一类毒素。表现出神经中毒的症状。第十四页，共六十六页，2022年，8月28日腹泻性贝毒检测腹泻性贝毒的分析主要采用荧光化合物ADAM标记－反相高效液相色谱分析的方法。由于ADAM不稳定，而且不易获得，因此又有了一些改进的方法，包括采用不同的衍生剂和提取方法。但由于目前样品前处理及色谱过程，对DSP结构类似物不能有效分离，因此HPLC法测定DSP效果不是很理想。目前HPLC-MS技术已用于DSP的分析，成为DSP液相色谱法的重要补充。第十五页，共六十六页，2022年，8月28日麻痹性贝类毒素检测麻痹性贝毒（PSP）是一类四氢嘌呤化合物，这类毒素通常是非结晶、高极性、难挥发的物质，检测方法主要采用液相色谱法。由于PSP本身生色基团很弱，不易被检测，因此检测前须氧化修饰，将PSP分子的环结构氧化成荧光生色基团。LC/MS和毛细管电泳/质谱（CE/MS）联用技术已用于麻痹性贝毒分析。第十六页，共六十六页，2022年，8月28日神经性贝毒检测神经性贝毒（NSP）色谱分析包括薄层层析法（TLC）和HPLC。TLC不够灵敏，目前已很少应用。HPLC法由于流出物背景干扰，在检测灵敏度和选择性方面存在问题。近年来，HPLC-MS联用技术开始应用于神经性贝毒分析。第十七页，共六十六页，2022年，8月28日河豚毒素(Tetrodotoxin)

河豚(Spheroidesvermicularis)又名钝鱼，它的某些脏器及组织中均含有毒素，是一种神经毒，其毒性稳定（220℃），经炒煮、盐淹和日晒等均不能被破坏，可使神经中枢和神经末梢发生麻痹。中毒症状始发于使用后10秒，先是口腔麻木和刺痛，继发为虚弱、麻痹、血压降低和脉搏快而弱，如不及时治疗可出现死亡。第十八页，共六十六页，2022年，8月28日河豚鱼第十九页，共六十六页，2022年，8月28日河豚毒素的毒性河豚毒素是一种毒性很强的神经毒素，它对神经细胞膜的钠离子通道有专一性作用，能阻断神经冲动的传异，使神经末梢和中枢神经发生麻痹。中毒初期表现为感觉神经麻痹，全身不适，继而恶心、呕吐、腹痛，O唇、舌尖及指尖刺疼发麻，同时引起外周血管扩张，使血压急剧下降，最后出现语言障碍，瞳孔散大，中毒者常因呼吸和血管运动中枢麻痹而死亡。死亡率高达50％。第二十页，共六十六页，2022年，8月28日第二十一页，共六十六页，2022年，8月28日

防止河豚毒素中毒的措施由于河豚毒素耐热，1200摄氏度加热60min才可破坏，一般家庭烹调方法难以去除毒素，故最有效的预防中毒措施：将河豚集中处理，禁止出售。在加工处理前必须先去除内脏、头、皮等含毒部位，洗净血污，经盐腌、晒干后，安全无毒方可出售，其加工废弃物应妥善销毁。第二十二页，共六十六页，2022年，8月28日河豚毒素的检测第二十三页，共六十六页，2022年，8月28日2、定量检测第二十四页，共六十六页，2022年，8月28日第二十五页，共六十六页，2022年，8月28日河豚毒素测定方法小鼠生物试验法免疫化学测定法毛细管等速电泳电压检测法荧光法TLC/火焰离子检测法TLC/快原子轰击质谱法HPLCHPLC/MS第二十六页，共六十六页，2022年，8月28日HPLC-MS测定河豚鱼中河豚鱼毒素1.前处理将河豚鱼肉或皮中的河豚鱼毒素用乙醇－乙酸－水（75：1：14）提取，过滤后，提取液经旋转蒸发浓缩，用离子交换树脂净化，用10％乙酸溶液洗脱。洗脱液经浓缩后用活性炭净化，用乙醇－乙酸－水（20：1：79）洗脱。洗脱液经浓缩后用水定容后供HPLC-MS测定。第二十七页，共六十六页，2022年，8月28日2.测定HPLC－MS条件：色谱柱：ShimpackCLC-ODS柱流动相：0.06M七氟丁酸－0.001M乙酸铵（pH5.0）流速：0.5mL/min样品不经柱前衍生加速电压：20kV第二十八页，共六十六页，2022年，8月28日真菌毒素真菌毒素（Mycotoxins）是某些丝状真菌产生的具有生物毒性的次级代谢产物，这些毒性真菌包括曲霉、青霉、镰刀霉、链格孢酶、棒孢酶和毛壳酶等。最先被分离纯化的真菌毒素是麦角生物碱（ErgotAlkaloid,1875)和青霉酸（PenicillicAcid,1913)。然而，对真菌毒素的真正研究却是从1962年黄曲霉毒素的发现开始的。第二十九页，共六十六页，2022年，8月28日黄曲霉毒素（Aflatoxin)黄曲霉和寄生曲酶是产生黄曲霉毒素的主要菌种，其他曲霉、毛霉、青霉、根霉等也可以产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素最常见于花生及花生制品，玉米、棉子和一些坚果类食品中，主要有黄曲霉毒素B1，B2，G1及G2等10多种。其中以黄曲霉毒素B1存在量最大且毒性最大。第三十页，共六十六页，2022年，8月28日黄曲霉毒素是已被证实的致癌物，其中黄曲霉毒素B1、M1是强致癌物。黄曲霉毒素作用机理是影响细胞膜，抑制RNA合成并干扰某些酶的感应方式。中毒症状无特异表现，临床可表现为发育迟缓、腹泻、肝肿大、肝出血、肝硬化、肝坏死、脂肪渗透和胆道增生等。1993年WHO的癌症研究机构将其划定为1类致癌物。它是致癌力最强的生物毒素，人类原发性肝癌的主要致病因素之一。第三十一页，共六十六页，2022年，8月28日黄曲霉毒素分析食品中黄曲霉毒素的测定，主要有TLC,ELISA,HPLC等方法。TLC法灵敏度和重现性较差；ELISA重现性差，易受样品基质干扰；HPLC法灵敏度和准确度高，重现性好，因此已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。第三十二页，共六十六页，2022年，8月28日HPLC法测定黄曲霉毒素，一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。在反相色谱中，B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化，提高其荧光强度，灵敏度才能满足一般食品法规的限量。衍生化的方法一般有柱前和柱后两类，柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学等方法。第三十三页，共六十六页，2022年，8月28日测定方法：主要有薄层色谱法、微柱色谱法及带荧光检测器的液相色谱法等，其中薄层色谱法为我国AFT标准分析方法中的第一法。

目前，实验室使用最多的是酶联免疫吸附剂（ELISA）试剂盒对AFTB1的残留量进行测定

第三十四页，共六十六页，2022年，8月28日酶联免疫吸附剂（ELISA）试剂盒是依据GB/T5009.22-2003第二法的原理制成的，测定的实质是采用酶标记的抗体或抗原与样品中的抗原或抗体间进行的抗原—抗体反应，加入显色液后，通过目测观察颜色来做快速的半定量的结果分析。

测定原理：样品中的AFTB1经提取、脱脂、浓缩后与定量的特异性抗体（抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体）反应，多余的游离抗体则与酶标板内的包被抗原（AFB1-BSA人工抗原）结合，加入酶标记物和底物后显色，与标准比较测定含量。第三十五页，共六十六页，2022年，8月28日注意事项：（1）由于食品中AFT分布很不均匀，特别是颗粒样品，为得到可靠的分析结果，采样时必须注意样品的代表性。（２）酶联免疫吸附剂（ELISA）试剂盒应放在４℃冰箱中避光保存，并在保质期内使用。（３）由于AFT是一剧毒且强致癌性物质，使用时应注意安全防护，实验时应戴口罩，戴手术手套。若衣服被污染，须用50%次氯酸钠溶液浸泡15～30min后，再用清水洗净。并注意做好实验后的清洗消毒工作，对于剩余的AFT标液或阳性样液，应先用50%次氯酸钠处理后方可倒到指定的地方，实验中所用的或被污染的玻璃器皿须经50%的次氯酸钠溶液浸泡５min再清洗之。实验完毕应用50%的次氯酸钠清洗消毒实验台等。第三十六页，共六十六页，2022年，8月28日第二节食品中有毒微生物的测定第三十七页，共六十六页，2022年，8月28日一、金黄色葡萄球菌的生物学特性

1、形态与染色：(staphylococcusaureus)

金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。革兰氏染色阳性。

附：金黄色葡萄球菌的显微照片

金黄色葡萄球菌的染色照片

金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片

金黄色葡萄球菌的透射电镜照片第三十八页，共六十六页，2022年，8月28日

金黄色葡萄球菌的显微照片

典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8mm左右，显微镜下排列成葡萄串状。

第三十九页，共六十六页，2022年，8月28日

金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片

金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜。革兰氏染色阳性。

第四十页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片StaphylococcusaureusEnhancedsemw:7.9micron

第四十一页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌的透射电镜照片Temx12000digitizedStaphylococcusaureus

第四十二页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌的检验增菌及分离培养吸取5mL混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，36℃±1℃培养24h，转种血平板和Baird-Parker平板，36℃±1℃培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。第四十三页，共六十六页，2022年，8月28日血平板上金黄色葡萄球菌菌落形态

金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色，有时也为白色，大而突出、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。

第四十四页，共六十六页，2022年，8月28日第四十五页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态

在Baird-Parker琼脂平板上菌落呈圆形，表面光滑、凸起、湿润，直径2～3mm。灰黑色至黑色，有光泽，常有浅色（非白色）的边缘，周围绕以不透明圈（沉淀），其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株，除没有不透明圈和清晰带外，其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落，其黑色常较典型菌落浅些，且外观可能较粗糙，质地较干燥。第四十六页，共六十六页，2022年，8月28日第四十七页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌在甘露醇盐平板上的菌落

Staphylococcusaureusonmannitolsaltsagar

第四十八页，共六十六页，2022年，8月28日3、血浆凝固酶试验：

吸取1:4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，置36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固,即将试管倒置或倾斜时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。第四十九页，共六十六页，2022年，8月28日第五十页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌肠毒素的检测

一、动物学试验主要用幼猫和猴。二、血清学试验肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，方法主要有：免疫琼脂扩散法反向间接血凝试验免疫荧光法酶联免疫吸附法

第五十一页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌快速检测方法目前，随着研究的深入，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基、API检测系统等。梅里埃公司生产的miniVIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素，在仪器上45min可以得到结果。第五十二页，共六十六页，2022年，8月28日法国梅里埃公司生产的RPF培养基凝固酶阳性葡萄球菌:菌落周围形成沉淀圈(例)金黄色葡萄球菌

-+将兔血浆包括在培养基中作为直接确认菌落的手段第五十三页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止带菌人群对各种食物的污染：定期对生产加工人员进行健康检查，患局部化脓性感染（如疥疮、手指化脓等）、上呼吸道感染（如鼻窦炎、化脓性肺炎、口腔疾病等）的人员要暂时停止其工作或调换岗位。

第五十四页，共六十六页，2022年，8月28日金黄色葡萄球菌污染的控制防止食品污染防止金黄色葡萄球菌对奶及其制品的污染：如牛奶厂要定期检查奶牛的乳房，不能挤用患化脓性乳腺炎的牛奶；奶挤出后，要迅速冷至-10℃以下，以防毒素生成、细菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶为原料，注意低温保存。对肉制品加工厂，患局部化脓感染的禽、畜尸体应除去病变部位，经高温或其他适当方式处理后进行加工生产。

第五十五页，共六十六页，2022年，8月28日防止金黄色葡萄球菌肠毒素生成

应在低温和通风良好的条件下贮藏食物，以防肠毒素形成；在气温高的春夏季，食物置冷藏或通风阴凉地方也不应超过6小时，并且食用前要彻底加热。第五十六页，共六十六页，2022年，8月28日第三节食品加工、贮藏过程中产生的有毒、有害物质的测定第五十七页，共六十六页，2022年，8月28日苯并芘的来源及性质：

苯并芘是已发现的200多种多环芳烃中最主要的环境和食品污染物，是一种强烈的致癌物质，对机体各器官，如对皮肤、肺、肝、食道、胃肠等均有致癌作用。加工过程中苯并芘对食品的污染主要是针对熏制、烘烤和煎炸等食品而言的，该类食品中的苯并芘一方面来源于煤、煤气等不完全燃烧，另一方面来源于食品中的脂肪、胆固醇等成分的高温热解或热聚。另外，由于输送原料或产品的橡胶管道，包装糖果、第五十八页，共六十六页，2022年，8月28日棒冰、面包等用的蜡纸，食品加工机械用的润滑油等都可能含有苯并芘，这样，就可能使得某些食品在加工环节中被污染。而且人们生活常用的煤、石油、天然气、木材等，当不完全燃烧时都会产生苯并芘；烧沥青和喷洒沥青时会有大量苯并芘散发在空气中，这些都可能造成污染，进而污染食品原料。第五十九页，共六十六页，2022年，8月28日

苯并芘又称3，4-苯并芘，是一种由五个苯环构成的多环芳烃。常温下苯并芘为浅黄色针状结晶，性质稳定，微溶于水、乙醇、甲醇，易溶于环己烷、己烷、苯、甲苯、二甲苯、丙酮等有机溶剂。在有机溶剂中，用波长365nm紫外线照射时，可产生典型的紫色荧光。苯并芘在碱性条件下较稳定。在常温下不与浓硫酸作用，但能溶于浓硫酸；能与硝酸、过氯酸、氯磺酸起化学反应，人们可利用这一性质来消除苯并芘。食品中苯并(a)芘在的测定方法有薄层层析法、荧光分光光度法、气相色谱和液相色谱法，这里介绍液相色谱法。第六十页，共六十六页，2022年，8月28日原理：利用氢氧化钾的甲醇水溶液皂化样品中的脂肪，多环芳烃以环己烷抽提，再用硫酸净化，经SephadexLH-20色谱柱富集样品中的多环芳烃，再通过液相色谱仪中的色谱柱，将苯并芘从多环芳烃物质中分离出来。与苯并芘标样比较定量。仪器：

(1)液相色谱仪：色谱柱：ODS柱，柱长250mm，Φ4mm；柱温：30℃；流动相：75％甲醇；流速：１.５mL／min。

(2)检测器：紫外检测器，波长287nm第六十一页，共六十六页，2022年，8月28日样品处理：（１）取熏烤肉样用热水洗去表面黏附的杂质、凉干、去骨头，将可食部分粉碎后备用。（２）样品的皂化、提取、净化、富集。