生化第四章氨基酸刘课件

第四章氨基酸内容氨基酸-蛋白质的构件分子氨基酸的分类氨基酸的酸碱化学氨基酸的化学反应氨基酸的光学活性和光谱性质氨基酸混合物的分析分离氨基酸的性质聚合能力酸碱性质侧链的结构手性

在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。

酸水解：6MHCl或4MH2SO4不消旋，得到L-氨基酸；色氨酸破坏、羟基氨基酸部分分解、天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基。蛋白质的水解

碱水解：多数氨基酸遭到不同程度的破坏，消旋，得到D-,L-型氨基酸的混合物；色氨酸稳定、精氨酸脱氨5MNaOH蛋白质的水解酶水解：不消旋、不破坏氨基酸、需要多种酶的协同作用；水解位点特异，水解时间长。用于一级结构分析蛋白质的水解氨基酸的结构肽键一分子氨基酸的α－羧基和一分子氨基酸的α－氨基脱水缩合形成的酰胺键，即-CO-NH-。氨基酸借肽键联结成多肽链。

蛋白质分子中的主要共价键，性质比较稳定。单键，具有部分双键的性质，难以自由旋转而有一定的刚性，因此形成肽键平面，包括连接肽键两端的C═O、Ｎ－Ｈ和2个Cα共6个原子的空间位置处在一个相对接近的平面上。一条多肽链的一端含有一个游离的氨基,另一端含有一个游离的羧基.肽键氨基酸的分类

1809年发现Asp，1938年发Thr，目前已发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种，称为基本氨基酸（编码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本aa经酶促修饰而来。

非蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸R基的化学结构分

R为脂肪烃基的氨基酸（5种）Gly、Ala、Val、Leu、Ile、R基均为中性烷基（Gly为H），R基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6.0±0.03）

Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。从Gly至Ile，R基团疏水性增加，Ile是这20种a.a中脂溶性最强的之一（除Phe2.5、Trp3.4、Tyr2.3以外）。R中含有羟基和硫的氨基酸（4种）含羟基的有两种：Ser和Thr。Ser的-CH2OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。Thr中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。Ser和Thr的-OH往往与糖链相连，形成糖蛋白。含硫的两种：Cys、Met。R中含有酸性基团及酰胺（4种）

Asp、Glu，一般称酸性氨基酸Asp侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86，Glu侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25，在生理条件下带有负电荷的仅有的两个氨基酸。R中含碱性基团（2种）Lys的R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3+），同时它的侧链有4个C的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接）Arg是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa值为12.48，生理条件下完全质子化。这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm处，Trp＞Tyr＞Phe。Phe疏水性最强。酪氨酸的-OH磷酸化是一个普遍的调控机制，Tyr在较高pH值时，酚羟基离解。Trp有复杂的π共轭休系，比Phe和Tyr更易形成电荷转移络合物。R为环状的氨基酸（2种）Pro(

His)

Pro是一种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化。His含咪唑环，咪唑环的pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者pKa为6.00，后者为7.35，它是20种氨基酸中侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。9种人体必需氨基酸的记忆口诀

①"借一两本蛋色书来"谐音:借(缬氨酸),一(异亮氨酸),两(亮氨酸),本(苯丙氨酸),蛋(蛋氨酸),色(色氨酸),书(苏氨酸),来(赖氨酸).

②"笨蛋来宿舍，晾一晾鞋"

笨（苯丙氨酸）蛋（蛋氨酸）来（赖氨酸）宿（苏氨酸）舍（色氨酸），晾（亮氨酸）一晾（异亮氨酸）鞋（缬氨酸）

氨基酸的名称与符号alanine 丙氨酸 Ala Aarginine 精氨酸 Arg Rasparagine 天冬酰氨 AsnAsx Nasparticacid 天冬氨酸 AspAsx Dcysteine 半胱氨酸 Cys Cglutamine 谷氨酰胺 GlnGlx Qglutamicacid 谷氨酸 GluGlx Eglycine 甘氨酸 Gly Ghistidine 组氨酸 His Hisoleucine 异亮氨酸 Ile Ileucine 亮氨酸 Leu Llysine 赖氨酸 Lys Kmethionine 甲硫氨酸 Met Mphenylalanine 苯丙氨酸 Phe Fproline 脯氨酸 Pro Pserine 丝氨酸 Ser Sthreonine 苏氨酸 Thr Ttryptophan 色氨酸 Trp Wtyrosine 酪氨酸 Tyr Yvaline 缬氨酸 Val V要求：能倒背不用的字母JUZBOX氨基酸名称与符号L型和D型的由来

甘油醛的旋光性L和D的来源左旋甘油醛的构型右旋甘油醛的构型按原子序数法确定了L型和D型氨基酸，但现在L和D已经不代表氨基酸的旋光性，只代表氨基酸的绝对构型。现在为了正确表示左旋和右旋，采用（＋）和（－）的符号，（＋）代表右旋，（－）代表左旋。从右旋的D型甘油醛出发，可以合成出左旋的D型乳酸。可以看出物质的旋光性与手性原子上的构型没有确定的关系。右旋D型甘油醛左旋D型乳酸L型氨基酸

与D型氨基酸L-aminoacidD-aminoacidL和D型氨基酸“

D/L”判断法

（看CAR的走向）

将H原子靠近自己，观察CAR的走向，逆时针（左转）为L型，顺时针（右转）为D型。

D：dextro

右C：carboxylgroup;

L：levo

左A：aminogroup;

R：residue;CCARRAL型D型L和D型氨基酸的判断拉丁语中苏氨酸Thr有四种异构体苏氨酸的异构体半胱氨酸Cysteine和胱氨酸Cystine

二硫键Disulfidebond二十种氨基酸的化学结构要求全部背出20种标准氨基酸的物化性质其他氨基酸的结构出现在蛋白质上的氨基酸修饰氨基酸修饰4-Hydroxyproline在胶原蛋白上;5-Hydroxylysine,6-N-methyllysine,desmocine在结缔组织中;Phospho-Ser,-Thr,-Tyr信号转导蛋白;γ-Carboxyglutamicacid凝血酶中;Pyroglutamicacid神经肽的N端;蛋白质中的氨基酸修饰1从各种生物分离到的氨基酸已达250种以上大量出现在胶原蛋白结缔组织修饰型氨基酸1羟赖氨酸结缔组织修饰型氨基酸2蛋白质中的氨基酸修饰2蛋白质上的氨基酸修饰

3凝血酶信号传导修饰型氨基酸3游离型氨基酸衍生物

4氨基酸衍生物Pyroglutamicacid(焦谷氨酸),神经肽的N端多数为焦谷氨酸游离型氨基酸衍生物氨基酸衍生物21号和22号primaryaminoacidOrnithine;Citrulline5’-HydroxytryptophanHomoaminoacids3,4-Dihydroxyphenylalanine(DOPA)γ-Aminobutyricacid(GABA)Mono,di,tri-iodotyrosine;thyroxineβ-Alanine,……etc游离型氨基酸衍生物

1氨基酸衍生物Hao,B.,etal.AnovelUAGencodedresidueinthestructureofamethanogenmethyltransferase.Science296:1462-1466,2002.SeC,硒半胱氨酸第21个一级氨基酸?PyL(吡咯赖氨酸),第22个一级氨基酸?游离型氨基酸衍生物

2氨基酸衍生物瓜氨酸(存在于尿素循环,从西瓜汁分离到)鸟氨酸(存在于尿素循环)游离型氨基酸衍生物

35’-hydroxytryptophan（5-羟色氨）HO“Thetasteoflove”

是松果体素(褪黑素,

melatonin)和血清素(serotonin)的前体。氨基酸衍生物游离型氨基酸衍生物

4

比通常的氨基酸多一个甲基，如Homoserine微生物、植物的代谢中间产物

HomocysteineHomocitrulline摄取高Lys含量的食物时从尿中排出Homomethionine*非天然产物

Met的分解产物，存在于S-adenosylhomo-cysteine和叶酸中.Homocysteine

Methionine氨基酸衍生物Epinephrine,肾上腺素tyrosinenorepinephrine去甲肾上腺素3,4-dihydroxyphenylalanineDOPA,多巴3,4-dihydroxyphenylethylalanineDopamine,多巴胺从Tyr衍生出来的重要生理物质，其中多巴是一种氨基酸。S-adenosylmethionineS-adenosylhomocysteine游离型氨基酸衍生物

5氨基酸衍生物

glutarmicacid

GABA,γ-aminobutyricacid

carnitine,肉毒碱（可用来减肥）味精是神经递质GABA的直接前体S-adenosylmethionineS-adenosylhomocysteine

游离型氨基酸衍生物

6氨基酸衍生物过量促进食欲,促肥胖tetraiiodotyrosine(thyroxine)

tyrosine

diiodotyrosine

monoiodotyrosine甲状腺内贮存碘的氨基酸triiodotyrosine

游离型氨基酸衍生物

7氨基酸衍生物氨基酸的理化性质无色晶体，熔点较高（200～300℃），水中溶解度各不同，取决于侧链。在紫外有特征吸收的仅三个芳香族的氨基酸Trp、Tyr、Phe,利用这一特点，可以通过测定280nm处的紫外吸收值的方法对蛋白溶液进行定量。氨基酸的理化性质

一般物理性质Trp,Tyr和Phe的紫外吸收有紫外特征吸收的氨基酸紫外光吸收的测定装置光吸收的测定氨基酸的旋光性与光谱性质氨基酸的旋光性：

氨基酸的构型（指α-碳）也以甘油醛为参考物，从蛋白质的酸水解或酶水解液中得到的都是L型，但D型氨基酸在自然界也存在；蛋白质用碱水解或有机合成氨基酸时，得到的都是无旋光性的DL-消旋物氨基酸的旋光符号和大小取决于R基的性质，与测定溶液的pH有关。比旋是ɑ-氨基酸的物理常数，是鉴别各种氨基酸的依据之一氨基酸的光谱性质：

参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见光区没有光吸收，在红外区和远紫外区都有光吸收，但在近紫外区只有芳香族氨基酸有光吸收；同一个氨基酸分子上可以同时携带正电荷和负电荷，称为两性电解质ampholyte。氨基酸的理化性质两性电解质氨基酸作为两性电解质氨基酸的酸碱性质

根据酸碱质子理论，HAA-＋H+氨基酸是两性电解质，既是质子供体，又是质子受体。当氨基酸完全质子化时，可看作是多元酸；COOH和NH3+可以发生解离，用Ka表示它们的解离常数；在氨基酸溶液中，pH值计算公式如下：

pH=pKa＋lg（[质子受体]/[质子供体]）侧链不解离的中性氨基酸看作二元酸酸性氨基酸和碱性氨基酸看作三元酸+A++A-A0A0Ka1=Ka2=[A0][H+][A+][A-][H+][A+]pH=pKa＋lg（[质子受体]/[质子供体]）当，pH=pKa1[A0]=当[A0]=[A-]，pH=pKa2[A0]Ka1Ka2氨基酸的酸碱滴定曲线氨基酸的酸碱滴定0.1HCl0.1HCl解离基团的pK值会发生较大的变化pK值的变化等电点(isoelectricpoint,pI)氨基酸、多肽等两（兼）性电解质[ampholyte]在溶液中所携带的净电荷[netelectriccharge]为零时的溶液的pH值。因此也叫isoelectricpH.氨基酸带电状况与溶液的pH有关。当pH大于等电点时，氨基酸带净负电荷；当pH小于等电点时，氨基酸带净正电荷！在一定的pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。氨基酸的甲醛滴定氨基酸酸碱滴定的等电点pH过高或过低，没有适宜的指示剂，因此，氨基酸虽然是两性电解质，但不能直接用酸碱滴定。在氨基酸中加入甲醛，甲醛与氨基酸中的氨基作用形成羟甲基衍生物，降低了氨基的碱性，使滴定终点移动。氨基酸的主要化学反应氨基酸的化学反应α-氨基参加的反应与亚硝酸反应（生成羟基氨基酸和氮气）与酰化试剂反应（氨基被酰基化而被保护）烃基化反应DNFB反应（生成DNP-氨基酸）PITC反应（生成PTH-氨基酸）形成西佛碱反应（与醛类化合物）脱氨基反应α-羧基参加的反应成盐成酯成酰氯（与二氯亚砜等）脱羧基反应叠氮反应（氨基酸酯与肼、亚硝酸）α-氨基与α-羧基共同参加反应与茚三酮反应（氨与还原茚三酮发生作用生成紫色物质）成肽反应侧链R基参加的反应酪氨酸酚羟基组氨酸咪唑精氨酸胍基色氨酸吲哚基半胱氨酸巯基H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸取代DNFB测定蛋白质N端氨基酸，灵敏度高酰化反应氨基酸与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应

（sanger反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色)++HF弱碱中氨基酸氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应

（Edman反应）PITC（phenylisothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA)（phenylisothiohydantion-AA）弱硷中(400

C)(硝基甲烷400

C)H+氨基酸的化学性质脱羧反应

NH2

IR-CH-COOH------R-CH2-NH2+CO2氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。

加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。

NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。3

注意：

脯氨酸与羟脯氨酸与茚三酮反应生成亮黄色化合物，最大吸收在440nm处。侧链R基参加的反应蛋白质的化学修饰在温和的条件下，以可控制的方式使蛋白质与某种试剂发生特异反应，引起蛋白质个别氨基酸侧链或官能团发生共价化学改变。用于结构与功能的研究氨基酸混合物的分析分离分离方法柱层析纸层析（相对迁移率，非极性性质）薄层层析离子交换层析（电荷和非极性）气相层析高效液相层析氨基酸洗脱顺序的判定：氨基酸与树脂的亲合力主要决定于它们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂聚苯乙烯之间的疏水相互作用；亲和力愈大愈难洗脱！层析分离根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。共同特点:一个固定相和流动相，当蛋白质混合溶液(流动相)通过装有珠状或基质材料的管或柱(固定相)时，由于混合物中各组份在物理化学性质(如吸引力、溶解度、分子的形状与大小、分子的电荷性与亲和力)等方面的差异使各组分在两相间进行反复多次的分配而得以分开。流动相的流动取决于引力和压力，不需要电流。用层析法可以纯化得到非变性的、天然状态的蛋白质。层析方法中凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等是目前最常用的层析方法。层析原理分配定律:Kd=cA/cB有效分配系数：Keff=某物质在A相中的总量/某物质在B相中的总量Keff=Kd*Rv,Rv=VA/VB逆流分配（反流分布法）是连续操作的多次液一液提取的分离方法。被分离的各个组分在两种不相混溶的溶剂中有不同的分配系数，以不同程度分配在两相中，其中一个相不断地向前移动，同时不断添加新鲜溶剂进行提取，经过多次操作后即可将复杂混合物分离。此法需要经过多次振摇提取，因而逆流分配代谢是由大量容器管连接组成，采用自动操作、自动提取分离。逆流分配仪体积较大，比较复杂，在使用上受到一定限制64溶剂A溶剂

B总量6432321616161688161644881212121244228812128822平衡后总量3232总量64转移1转移3转移2转移4总量163216总量824248总量41624164分管号码12345物质Y(Kd=1)的分配情况理论塔板数与粒子半径成反比理论塔板决定层析效果

因此层析载体的粒径越小，分离效果越好。这就是为什么要发展高效液相色谱（HPLC）理论塔板数将色谱柱比作蒸馏塔，把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内，一部分空间为固定相占据，另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后，就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡，这样一个小段称作一个理论塔板（theoreticalplate），一个理论塔板的长度称为理论塔板高度（theoreticalplateheight）H。由于色谱柱内的塔板