一种新的乙肝诊断血清免疫学指标－乙肝病毒大蛋白课件

一种新的乙肝诊断血清免疫学指标

－－－－乙肝病毒大蛋白

乙型肝炎流行现状乙型肝炎是一个严重的公共卫生问题。全球60亿人口中，约1/2人口生活在HBV高流行区，约20亿人证明有HBV感染，3～4亿人为HBV慢性感染，其中25%～40%最终将死于肝硬化和肝癌。全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡约75万例中国乙型肝炎流行现状(一)HBeAg阴性活动期肝炎增多(二)HBV变异株增加HBV的突变率较高，

HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg阴性乙肝与HBeAg阳性乙肝不同点：(1)慢性肝炎病情不减轻；(2)生化学和病毒学标志反复升高；(3)可30～40年无症状；(4)约45岁左右发生肝硬化；(5)10年后约25%发生并发症。HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg阴性的慢性乙肝流行率升高原因：(1)持续免疫压力导致突变株选择；(2)长期治疗导致病毒变异；(3)前C和C启动子变异；(4)检测方法的灵敏度提高。

HBeAg阴性活动期肝炎HBeAg阴性活动期肝炎临床诊断现状：(1)传统“两对半”指标不能反映此类患者HBV复制程度；(2)缺乏指导合理治疗的指标；(3)HBVDNA检测不易于各级医疗机构广泛开展；(4)临床上急需能够反映HBV复制程度及指导治疗的指标。

抗病毒治疗效果监测临床上缺乏评估抗病毒治疗效果的指标。以HBVDNA阴转作为治疗的终点不恰当，此时停药病情易反复。乙肝病毒实验室检测的缺陷

抗病毒治疗效果评价血清学指标缺乏

临床上评价抗乙肝病毒治疗效果时存在一个很大的问题，即其评价指标主要是肝功能的改善与否、血清乙肝病毒DNA水平的变化以及肝组织的病理学改变等。诚然，这些指标对临床医生判断患者病情而言非常重要和实用，也是临床医生选用抗乙肝病毒药物时的依据，然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后乙肝病毒是否会重新复制活跃导致乙肝复发则缺乏客观而有效的指标。

乙型肝炎血清学诊断技术新突破

乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）前S区酶免定量试剂盒

-------直接定量检测乙肝大蛋白-------不用分开检测前S1和前S2乙肝病毒包膜蛋白研究进展1995-2004年发现大蛋白前S区有复杂构象结构1996年发现大蛋白具有反式激活病毒复制的作用2002年发现导致肝细胞病变及凋亡的主要原因是大蛋白2004年实验室成功构建针对构象型抗原的单克隆抗体2005年国内公司成功研制乙肝表面抗原大蛋白酶联免疫定量试剂盒HepatitisB——乙型肝炎HBV模型HBV的表面抗原的组成HBV病毒结构成分HBV-LP与病毒复制密切相关HBVDane管形球型血流中的分布L-HBs大蛋白存在存在不含仅病毒复制期存在M-HBs中蛋白存在存在1%含量非复制期少量存在S-HBs小蛋白存在存在存在存在根据检测血液中大蛋白的有无，判断病毒携带者体内的HBV病毒是否在进行复制。PrangeR,StreeckRE.NoveltransmembranetopologyofthehepatitisBvirusenvelopeproteins.EMBOJ1995;14:247-256LambertC.etal.Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnaviral

lareenvelopeproteinsJ.GeneralVirology200485,1221-1225.乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究HBV病毒颗粒表面的PreS已经被证实具有独立的结构域和天然构象很多研究致力于表达并观测PreS的结构，但是极少成功。其原因是单独表达的PreS很容易被蛋白酶所降解。(A)内质网（ER）膜上乙肝大蛋白的拓扑结构模型。(B)病毒体包膜上的乙肝大蛋白的拓扑结构模型。VolkerBruss,XuanyongLu1,ReinerThomssenandWolframH.Gerlich'.Post-translationalalterationsintransmembranetopologyofthehepatitisBviruslargeenvelopeprotein.TheEMBOJournalvol.13no.10pp.2273-2279,1994乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究HBVL包膜蛋白（大蛋白）的结构域和穿膜拓扑结构

A.大蛋白的构成组分，含preS1、preS2及S结构

B.大蛋白在内质网（ER）膜上的拓扑结构CarstenLambert,SylviaMannandReinhild

Prange.Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallargeenvelopeproteins.JournalofGeneralVirology(2004),85,1221–1225乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究L蛋白i-pre-S形式的功能模式图。黑点表示L蛋白pre-S结构略去S和M蛋白分泌的病毒体表面的e-pre-S结构很可能具有结合病毒受体的功能。目前的数据显示L蛋白的i-pre-S结构是一种蛋白矩阵，在病毒体的形成过程中负责与核壳体相接触，包装外膜。VOLKERBRUSS*ANDKERSTINVIELUF.FunctionsoftheInternalPre-SDomainoftheLargeSurfaceProteininHepatitisBVirusParticleMorphogenesis.JOURNALOFVIROLOGY,Nov.1995,p.6652–6657Vol.69,No.11肝炎病毒物种特异性的感染取决于病毒进入的水平，并由病毒L蛋白上的pre-S结构决定。

Arg103和Ser124之间的序列在不同的HBV之间是高度保守的。Arg103和Ser124之间的pre-S序列对于HBV的形成具有重要功能。ＡＡ１０３－１２４横跨前Ｓ１和前Ｓ２之间乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究VOLKERBRUSS.AShortLinearSequenceinthePre-SDomainoftheLargeHepatitisBVirusEnvelopeProteinRequiredforVirionFormation.JOURNALOFVIROLOGY,Dec.1997,p.9350–9357Vol.71,No.12TAKASHIISHIKAWAANDDONGANEM.Thepre-SdomainofthelargeviralenvelopeproteindetermineshostrangeinavianhepatitisBviruses.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.92,pp.6259-6263,July1995

BrunsM,MiskaS,ChassotS,WillH.EnhancementofhepatitisBVirusinfectionbynoninfections

subviralparticles.JVirol,1998;76;1462-8.乙肝鸭模型证实由大蛋白组装成的亚病毒颗粒能够反式激活病毒继续复制这个研究具有临床意义,对于大蛋白阳性而DNA阴性患者容易停药反跳具有参考意义.亚病毒颗粒上pre-S的反式激活作用原文：UltrastructuralAnalysisofHepatitisBVirusinHepG2-TransfectedCellsWithSpecialEmphasisonSubviralFilamentMorphogenesis作者：PHILIPPEROINGEARDANDCAMILLESUREAU作者单位：LaboratoiredeBiologieCellulaire,EPCNRS117,Faculte´deMe´decinedeTours,2bisBoulevardTonnelle´,F-37032ToursCedexFrance.发表刊物：HEPATOLOGYVol.28,No.4,1998

在乙肝病毒感染的HepG2细胞中对亚病毒纤维体的形态发生进行的超微结构分析大蛋白与肝细胞病变研究大蛋白的过量表达,管状颗粒在细胞内堆积,导致体外培养的细胞5天内死亡Chisari等和Fernandes等已经证实，在转基因小鼠中过量表达大的表面蛋白会使肝细胞凋亡并且产生慢性肝炎。然而，在他们模型中的这种损伤相对比较温和，没有小鼠死于肝功能衰竭.转基因小鼠的肝细胞带有这种蛋白L的积累滞留，则会发展为细胞的损伤作用，它会诱导肝的再生，在这个模型中最终导致肝癌大蛋白导致肝细胞病变研究大蛋白是导致FCH中肝细胞损伤,纤维化的主要原因FCH与肝细胞内大蛋白过量表达蛋白L的滞留也被发现和一种独特的综合症，即纤维淤胆性肝炎（FCH）相联系，它的特征为肝细胞的空气球化和有着显著的胆汁阻塞，但是它一般只有很少的炎症发生，它发生于免疫抑制的乙肝携带者。来自于发生了FCH的病人的肝脏样品，通过电镜观察发现在细胞内膜系统中有着同样的乙肝亚病毒包膜纤维体的积累。2002年国际肝病杂志实验证实，表达的乙肝大表面蛋白致使培养的肝细胞在一些天内死亡。乙肝大的表面蛋白会致使体外培养的细胞的液泡化和细胞凋亡。这些结果和FCH下的肝脏病理情况相当地相似，国内pre-S研究（部分）文献一：EstablishmentandprelimineryuseofhepatitisBVirusPreS1/2antigenassay

WorldJourneryofGastroenterology99年军事医学科学院３所文献二ＥxpressionandpurificationofthecompletepreSregionofhepatitisBVirusWorldJournalofGastroenterology2005年中科院上海生化和细胞所抗原表位目前生物科学领域，对天然表位的研究借助现代科学技术的进步，对表位已经有比较深刻的认识。表位的构成方式至少有两种：①由某些氨基酸残基按一定顺序连续排列组成的线状序列，称为顺序（sequential）表位或线性(linear)表位。顺序表位是蛋白分子的一级结构，比较稳定，不受蛋白质加热变性和空间构形改变的影响。②由分子内不连续的2～3个氨基酸残基折叠排列所形成的三维结构构成，称为构象(conformational)表位；有时候，呈α螺旋式排列的连续肽链序列也可起到构象表位的作用。多肽无法模拟构象表位商品化的前S1定性检测试剂上市，其单抗是用AA21-47化学合成的多肽而制作的。而应用该多肽免疫制作的抗体在科研中就已经发现，只能检测到微弱的抗-pre-S1抗体的产生多肽无法模拟构象表位Schodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多肽免疫Balb/c小鼠，诱导生成的抗pre-s1抗体的滴度只有160，上海生化所改进应用pre-S1-BSA偶联复合物免疫Balb/c小鼠，也只能检测到微弱的抗Pre-S1的活力，

目前临床使用乙肝前S1以及前S2试剂大部分研究主要集中在前S1区、前S2区。研究表明前S1区、前S2区蛋白及其抗体都与HBV-DNA、HBeAg、肝脏损害、乙肝的转归等都有极其密切的关系。临床应用：前S1试剂、前S2试剂诊断的结果与HBV-DNA、HBeAg

三者之间有一定的关系，但符合率却只有６0－８０%，甚至更低。杨海林等完整病毒颗粒Dane颗粒标志物PreS1蛋白药盒的研制上海医学检验杂志1995vol.10:204-206杨海林等抗乙肝炎病毒表面抗原PreS1（20－47）多肽的制备、性质和应用。生物化学与生物物理学报1994vol26145-151使用针对化学合成多肽的单克隆抗体，无法定量监测，无法用于疗效观察临床应用４－５年，灵敏度不理想，目前临床使用乙肝前S1以及前S2试剂乙肝大蛋白定量诊断试剂应用结构生物学、蛋白晶体学的研究，研发出针对乙肝病毒前S区的构象型单抗，大大提高了乙肝病毒感染者中前S区抗原即LP大蛋白的检出率，临床应用表明大蛋白的检出率与血液中病毒DNA的符合率高度符合（＞90%）。比原来的前S1试剂效果大大提高，可作为病毒复制的一个指标。乙肝大蛋白Ｐre-S抗原蛋白晶体结构HBV-lp晶体结构—空间模型针对大蛋白构象表位单抗研制简要过程

（本方法是我们已经申请的专利的一部分）获得体外重组的PRE-S抗原获得多抗，亲和层析从强阳性标本中获得病毒样颗粒病毒样颗粒制作抗体大蛋白试剂临床研究1、HBVDNA阳性标本中HBV－LP的阳性符合率考核单位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）例（次）数例（次）数比例（％）北京地坛医院126825494.78北京地坛医院2（治疗系列）115214998.03解放军传染病研究所17013579.41辽宁沈阳传染病医院14313493.71浙江省湖州中心医院（治疗系列）213312896.24合计84878392.33注：1阿德福韦抗病毒治疗患者43例，共检出HBVDNA阳性152次；2拉米夫定抗病毒治疗患者51例，共检出HBVDNA阳性133次。2、不同HBVDNA拷贝数中HBV－LP阳性率以及OD值比较大蛋白试剂临床研究组别HBVDNA大蛋白试剂结果HBVDNA拷贝数例数阳性例数阳性率（％）大蛋白OD1＜104(阴性)842321.380.266±0.0442104432967.440.416±0.0813105634673.020.504±0.2054106242187.500.898±0.1805107171694.121.275±0.31961082323100.001.428±0.238注：解放军传染病研究所，HBVDNA拷贝数对数值与HBV－LPOD值的相关系数r=0.945大蛋白试剂临床研究组别HBVDNA大蛋白试剂结果HBVDNA拷贝数例(次)数阳性例(次)数阳性率（％）阳性含量均值（ng）1103544888.8917.602104383797.3724.693105585696.5530.444106656396.9255.465＞106808010086.61合计/29528195.25/注：北京地坛医院与沈阳传染病医院汇总，其中北京地坛医院为阿德福韦抗病毒治疗患者标本。HBVDNA拷贝数对数值与HBV－LP含量（ng）的相关系数3、不同HBVDNA拷贝数中HBV－LP阳性率以及含量比较r=0.935大蛋白试剂临床研究4、HBV－LP试剂与乙肝前S1试剂比较大蛋白试剂临床研究考核单位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）乙肝前S1（＋）例数例数比例（％）例数比例（％）北京地坛医院26825494.7817665.67解放军传染病研究所17013579.419757.06合计43838988.8127362.33大蛋白试剂临床研究考核单位HBVDNA（＋）HBV－LP（＋）HBeAg（＋）北京地坛医院沈阳传染病医院例数例数比例（％）例数比例（％）39136894.1217745.275、HBVDNA、HBeAg与HBV－LP三者在乙肝患者中的比较5、HBVDNA、HBeAg与HBV－LP三者在乙肝患者中的比较大蛋白试剂临床研究HBVDNA（＋）HBeAg(＋)HBeAg(—)合计177#214*391HBV－LP（＋）172（97.18%）196（91.59%）368（94.12%）注：#其中北京地坛医院109份；沈阳传染病医院68份*其中北京地坛医院159份；沈阳传染病医院55份6、不同HBV模式的患者中HBV－LP与HBVDNA的比较大蛋白试剂临床研究HBVM

模式例数HBVDNA（＋）例数阳性率(%)HBV－LP（＋）例数阳性率(%)HBsAg(+)HBeAg(+)HBcAb(+)21820292.6720694.50HBsAg(+)HBeAb(+)HBcAb(+)20716780.6815876.33HBsAg(+)HBeAg(+)231982.611878.26HBsAg(+)HBcAb(+)371335.141643.24合计48540182.6839882.06大蛋白试剂临床研究7、HBV－LP试剂盒抗干扰能力的考评考核单位干扰血清HBV－LP结果所患疾病例数阳性例数阳性率（％）北京地坛医院甲肝800丙肝800戊肝800两种肝炎混合感染*600沈阳传染病医院丙肝2000合计/5000注：*含甲肝乙肝混合感染、丙肝乙肝混合感染以及戊肝乙肝混合感染各2份8、HBV－LP试剂盒的特异性考评大蛋白试剂临床研究考核单位考评标本HBV－LP结果标本来源例数阳性例数阴性例数特异性（％）河北省血液中心正常献血员21183211599.86解放军传染病研究所体检健康者1000100100北京地坛医院体检健康者57057100合计/22753227299.87大蛋白试剂临床研究9、HBV－LP用于抗病毒治疗的监测北京地坛医院进行了阿德福韦治疗患者的过程监测浙江湖州中心医院进行了拉米夫定治疗患者的过程监测北京大学生物系进行了干扰素治疗患者的过程监测北京地坛医院阿德福韦治疗监测地坛阿德福韦治疗系列血清典型病例典型分析药物治疗无效病例治疗现有效果后反跳治疗先有效后反跳治疗先有效后反跳治疗先有效后反跳浙江湖州中心医院拉米夫定治疗监测抗病毒治疗过程中HBVDNA阴转不能做为治疗终点的指标，HBVDNA阴转之后患者的病情会出现反