束永前ngs肺癌临床应用束永前ws课件

1NGS在肺癌精准医疗中的应用

高通量测序技术的发展及研究报道高通量测序技术在肿瘤临床的应用1目录

TableofContents3SequencingGetsCheaperandFaster单人全基因组测序成本（美金）：HGP: $3Billion2004: $30,000,0002008: $100,0002010: $10,0002011: $4,0002014: $1,000???: $100测序成本迅速下降，超过了摩尔定律

Cost

isDecreasingExponentially,BeatingMoore’sLaw562013年NEJM发表的临床文献，43%运用高通量技术目前高通量测序大量应用于国内外临床癌症研究21世纪的癌症分型需要病理和分子联合进行

–ASCO2014,Chicago,Dr.MStratton(英国首相医学顾问）7在不同病理类型中，肺癌驱动基因突变谱存在明显的差异早期肺腺癌中EGFR突变率和晚期相似ZhangX,etal.2013ASCOAbstract1547.YangPC,etal.2012ASCOAbstract1534.2013ASCO早期NSCLCICANEGFR突变状态(%)2012ASCO晚期NSCLCPIONEEREGFR突变状态(%)8023：NTRK1基因融合作为肺癌新的癌基因靶点结论在肺腺癌中通过NGS/FISH发现了一种新的癌基因NTRK1融合需要开展更多研究以明确NTRK1融合在肺癌中的发生率和特征该研究提示需要在NTRK1融合阳性患者中开展前瞻性Trk抑制剂的临床研究35例泛阴性(EGFR,KRAS,ALK,ROS1)肺腺癌样本新的Break-Apart

FISH检测

第2代测序技术(CLIA认证实验室)对表现为新NTRK1基因融合的细胞进行转录及药理抑制分析56例泛阴性(EGFR,KRAS,ALK,ROS1,RET)肺腺癌样本DoebeleRC,etal.2013ASCOAbstract8023.3/91(3.3%)肺鳞癌驱动基因突变研究71肺鳞癌病人标本NGS和定量PCR检测突变和基因扩增基因名称突变频率TP5359.2%PI3KCA19.7%FGFR21.4%HRAS2.8%APC1.4%KRAS1.4%MET1.4%EGFR4.2%AKT11.4%PTEN1.4%SMAD41.4%KIF5B-RET1.4%FGFR31.4%基因名称变异类型频率CDKN2A缺失/突变/甲基化72%PI3KCA突变16%PTEN突变/缺失15%FGFR1扩增15%EGFR扩增9%PDGFRA扩增/突变9%CCND1扩增8%DDR2突变4%BRAF突变4%ERBB2扩增4%FGFR2突变3%KohY,etal.2013ASCOAbstract7572.GovindanR,etal.2012ASCOAbstract7006.2013ASCO

178例肺鳞癌标本127例（75%）患者确认潜在治疗靶点检测基因拷贝数，外显子突变，mRNA表达和启动子甲基化2012ASCO40.9%的鳞癌患者存在联合基因突变，表明了鳞癌患者基因型的复杂性13手术切除的肺鳞癌患者中FGFR1扩增对预后的影响63例经组织病理学证实、临床已切除肺鳞癌评估FGFR1状态与临床特征#和DFS*之间的关系FGFR1扩增定义为FGFR1拷贝数≥2.2xCEP8拷贝数结果：FGFR1扩增与年龄(p>0.99)、性别(p>0.99)、吸烟史(p=0.32)或疾病分期(p=0.18)之间无相关性多因素分析发现，FGFR1扩增与DFS改善显著相关(HR3.2,95%CI1.1-9.4)HellmannMD,etal,etal.2013ASCOAbstract7559.*Log-rank，#Fisher’s精确检验PI3K通路驱动IV期肺鳞癌患者的转移模式和生存68例IV期肺鳞癌患者的FFPE肿瘤标本FGFR1扩增(FISH)PIK3CA突变(Sequenom)PTEN缺失(IHC)PTEN突变(外显子测序)采用Kaplan-Meier法估算生存率采用Log-rank检验和Cox比例风险法进行组间比较PaikPK,etal.2013ASCOAbstract8022.PI3K通路驱动IV期肺鳞癌患者的转移模式和生存OS单因素分析：OS多因素分析：考虑到年龄、性别、KPS因素后，仍然显示PI3K与生存期短相关HR=3.3，(95%CI:1.5-7,p=0.03)

转移部位的驱动基因分析脑转移在鳞癌中不常见，但在PI3K异常肿瘤高达22%脑转移仅出现在PI3K异常肿瘤PaikPK,etal.2013ASCOAbstract8022.OS95%CIP值(vs其他)FGFR1扩增19.510.8-NR0.059PI3K9.498.1-NR0.004其他13.79.7-NR结论：IV期PI3K异常肺鳞癌患者的生存较差脑转移在PI3K异常的患者中更常见，且仅出现在PI3K异常的患者中PI3K通路活化具有不同的生物学特点，以该通路为靶点的治疗方法可能是伴脑转移的肺鳞癌患者的一种有效治疗策略靶向治疗耐药后基因突变研究针对驱动基因突变研制的分子靶向药物在晚期NSCLC治疗方面已经显现出巨大的优势。表皮生长因子受体(EGFR)敏感突变的患者，可从EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗中获得更好的疗效，但几乎所有患者迟早均要发生EGFR-TKI获得性耐药，中位无进展时间只有8~12个月当靶向治疗后出现耐药时，临床上面临众多治疗困惑，也是当今肺癌个体化治疗的研究热点之一靶向治疗耐药机制（1）EGFR二次突变，例如20外显子T790M、T854A、L747S、D761Y等。（2）下游信号传导通路基因突变，例如RAS、RAF、PI3CA、PTEN等。（3）旁路激活，例如HER2扩增或突变、MET基因扩增、ALK基因融合ROS1基因融合、AXL基因扩增等。（4）表皮间质化（EMT）。（5）转化为SCLC。EGFR-TKI耐药机制：EGFR二次突变&其他致癌基因激活同时有EGFR扩增机制不明SCLC转化T790MSequistLV,etal.SciTranslMed2011;3(75);AdaptedfromSequistLV,etal.2012ASCO.EGFR-TKI治疗NSCLC耐药过程中

cMET/ErbB3激活和过表达的作用无论EGFR突变状态如何，EGFR/cMET相对水平高的患者PFS显著更好随着cMET参与的程度越高或E/M指数越低，NSCLC的临床获益越差PFS越短(<8个月)的患者总体和磷酸化ErbB3水平(阳性率67%vs.27%)显著高于PFS越长(>8个月)的患者结论：cMET和ErbB3在NSCLC患者对EGFR-TKI产生耐药过程中具有重要作用E/M指数及其活化可作为选择EGFR抑制剂和cMET抑制剂的预测标志物，但还需要前瞻性临床研究的验证AhnMJ,etal.2013ASCOAbstract11113.NGS发现NSCLC靶向治疗新的合并突变在人类H3255NSCLC细胞株(携带EGFRL858R，但无BRAFV600E，对厄洛替尼敏感)中，BRAFV600E的过表达会导致耐药性的产生BRAFV600E介导的厄洛替尼耐药可通过BRAF抑制剂Vemurafenib逆转结论：EGFR突变NSCLC可包含额外BRAF致癌驱动突变且在治疗前发生率低EGFRTKI治疗可以导致BRAFV600E表达肿瘤细胞扩增，产生获得性EGFRTKI耐药，而BRAF抑制剂治疗后可逆转突变率治疗前EGFRL858R95%BRAFV600E～6%获得耐药性后EGFRT790M～14%BRAFV600E60%10倍BlakelyCB,etal.2013ASCOAbstract11004.收集EGFR-TKI治疗前及EGFR-TKI耐药后的FFPE标本，使用IlluminaHiSeq2000进行398个肿瘤相关基因的外显子测序伴T790M突变的EGFR突变型NSCLC患者

中ROR1mRNA表达（来自EURTAC研究）入组EURTAC研究中的95例患者：65%伴有治疗前T790M突变，评估45例患者的ROR1表达与治疗和生存的关系厄洛替尼组(n=24)化疗组(n=21)同时伴T790M突变、接受厄洛替尼治疗的患者(n=15)ROR1高表达ROR1低/中表达ROR1高表达ROR1低/中表达ROR1高表达ROR1低/中表达中位PFS,月5.811.895.62.710.8P值0.0330.0174结论：高ROR1表达显著限制伴T790M突变患者的PFSROR1导向治疗可提高厄洛替尼治疗伴ROR1过表达的EGFR突变型NSCLC患者的疗效*仅在低ROR1表达者中有效KarachaliouN,etal.2013ASCOAbstract11027.第三代EGFR-TKI已经初步确立了临床疗效靶病灶自基线最大变化(%)

(T790M+可评估患者，扩大队列[N=107])ORR=64%(69/107)DCR(CR+PR+SD)=94%(101/107)40200-20-40-60-80-10020mgQD40mgQD80mgQD160mgQD240mgQDJannePA,etal.2014ASCOAbstract8009.通过NGS发现C797S突变为AZD9291的获得性耐药突变Thressetal,NatMed.2015,doi:10.1038/dm.3854NGS的临床应用探索仍在继续

-----2015ASCO最新报道29世和基因版权所有EGFR信号通路（红色为世和检测的重要节点基因）EGFR为肺癌最主要用药基因常见突变集中于18，19，20，21外显子；但突变类型多变，包括点突变，缺失，插入，拷贝数变化。这些对用药都有极其重要意义传统热点检测只能检测一种突变类型如点突变，往往漏掉许多重要信息基因上下游综合信号通路分析也至关重要，如RAS-RAF-MEK-ERK及PI3K-AKT等NGS与肺癌EGFR专题3031EGFR少见突变研究进展

UnusualmutationofEGFREGFR基因常见激活突变21外显子L858R、19外显子非移码插入突变目前检测较多18-21外显子其他敏感突变如G719Xaa、L861Q、S768I目前检测较少最新大样本研究结果显示，在3项肺癌临床实验600例肺癌患者中，12%（75/600）肺癌患者携带18-21外显子少见突变（如G719Xaa、L861Q、S768I），并根据突变情况分成三组，给予阿法替尼给药治疗。第一组：18-21外显子少见点突变第二组：单独T790M突变或者T790M突变与其它突变共存第三组：EGFR基因20外显子插入突变分组Group1Group2Group3ORR71.1%14.3%8.7%MPFS10.7month2.9month2.7monthMOS19.4month14.9month9.2monthJamesC-HYangetal.Lancetoncology2015发现耐药机制

RevealDrugResistance耐药机制突变所占比例临床意义及治疗方案选择EGFR基因T790M突变50%一代EGFRTKI抗药，二代TKI如阿法替尼仍部分有效，三代针对此突变的TKI如AZD9291高度有效EGFR基因20外显子非移码插入突变4-9.2%一代、二代EGFRTKI均可能抗药ALK基因融合3%-7%ALKTKI如克唑替尼、色瑞替尼有效；一代EGFRTKI抗药ALK基因融合并携带特定点突变未统计一代ALKTKI如克唑替尼可能抗药；二代ALKTKI如色瑞替尼部分有效BRAF基因V600E激活突变1%-2%一代EGFRTKI抗药；BRAF抑制剂如威罗菲尼、达拉菲尼可能有效BRAF基因15外显子其他激活突变1%-4%一代EGFRTKI可能抗药HER2基因20外显子非移码插入突变2%-4%一代EGFRTKI可能抗药，二代TKI如阿法替尼仍有效HER2单抗如赫塞汀可能有效KRAS基因2、3、4外显子激活突变15%-25%一代EGFRTKI抗药；MEK抑制剂可能有效MEK1基因特定激活突变1%一代EGFRTKI抗药；MEK抑制剂可能有效MET/HGFR基因扩增5%-20%一代EGFRTKI抗药；MET抑制剂如克唑替尼可能有效NRAS基因2、3外显子激活突变1%一代EGFRTKI抗药；MEK抑制剂可能有效PIK3CA基因9、20外显子激活突变5%一代EGFRTKI抗药；MTOR抑制剂如伊维莫司可能有效PTEN基因截短失活突变如R233*4%-8%一代EGFRTKI抗药；MTOR抑制剂如伊维莫司可能有效ROS1基因融合2%ROS1TKI如克唑替尼有效；一代EGFRTKI可能抗药发现耐药机制实现个体化治疗，真正做到“对症下药耐药机制也是临床科研领域的热门领域，高分值科研成果322015年ASCO会议报道EGFR-TKIs新耐药机制332015年ASCO会议报道了肺癌两种驱动突变，同时也是EGFR-TKIs耐药机制：MET基因14外显子缺失和NF1基因失活突变突变MET基因14外显子缺失NF1基因失活突变突变解释MET基因14外显子缺失引起MET蛋白与c-CBL结合能力缺失，抑制c-CBL对MET的泛素化，抑制MET蛋白溶酶体降解途径，导致MET蛋白水平升高。NF1基因介导KRAS-GTP向KRAS-GDP转化过程，NF1失活导致其对KRAS抑制活性缺失，KRAS持续激活下游信号通路用药相关EGFR-TKIs耐药MET抑制剂如克唑替尼可能有效EGFR-TKIs耐药MEK抑制剂可能有效突变特点全新的突变类型—剪切突变（常见突变类型包括拷贝数变化、碱基置换突变、缺失突变、插入突变、染色体断裂重排）无突变热点—抑癌基因失活(肿瘤中原癌基因突变主要集中在结构域、结合位点等热点位点，抑癌基因不存在突变热点，全基因各区域均可能发生失活突变)检测方法高通量测序或PCR方法高通量测序P.Paiketal.2015ASCOAbstract8021；PA.Redigetal.2015ASCOAbstract80222.总结随着研究的深入，我们不断发现新的肺癌驱动基因，不断完善肺癌的驱动基因谱，并研发新的靶向治疗药物EGFR基因是突变概率最大、最多病人治疗获益的靶点，尤其是在亚裔患者，除了常见位点，携带少见EGFR突变，通过NGS检测出来仍然能通过靶向药物获益由于原发或继发性耐药的发生，未来驱动基因的检测决不是一次性就可解决的问题，需要伴随治疗过程进行动态的检测测序技术的不断发展优化是未来根据驱动基因选择靶点治疗的技术保证，是个体化治疗的基础高通量测序技术的发展及研究报道高通量测序技术在肿瘤临床的应用2目录

TableofContents35精准医学时代的到来肺癌精准医学是精确诊断与靶向治疗的结合精确诊断靶向治疗分子靶点药物EGFR吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、CO-1686,AZD9291ALK克唑替尼、AlectinibMetTivantinib(ARQ197),Onartuzumab(MetMab)Cabozantinib(XL184)FGFR1Nintedanib,XL999HER-2阿法替尼RET/ROS融合基因克唑替尼,AP26113,ASP3026RAS/MAPK通路Trametinib(GSK1120212)，Pimastertib，Refametinib,TAK733……PI3K/PTEN/AKTBEZ235,XL-765……PD-1/PDL-1Nivolumab,MPDL3280AHSP90…..Ganetespib未来5年内靶向临床药物的选择将会有一个爆炸性的增长

ExplosiveGrowthforTargetsTherapiesExpectedinNext5YearsFDA统计于2012年38肺癌临床药物及治疗

TargetedTherapiesinLungCancer39英文药名中文药名药敏基因备注Bevacizumab贝伐单抗VEGFR1,VEGFR2,VEGFR3等--Erlotinib特罗凯EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等一代TKIGefitinib易瑞沙EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等一代TKIIcotinib埃克替尼EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等一代TKICetuximab西妥昔单抗EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等贵，T790M突变可用Crizotonib克唑替尼EML4-ALK融合，ALK扩增，ROS1，MET等贵，一代ALK抑制剂肺癌靶向药物极多且选择逻辑复杂，目前在国内上市的肺癌药物有以下六种此外肺癌还有20款以上药物在国外上市或处于临床实验中，包括AZD9291、CO-1686等肺癌临床药物及治疗

TargetedTherapiesinLungCancer英文药名中文药名药敏基因备注Ramucirumab雷莫卢单抗VEGFR2贵，国外上市Afatinib阿法替尼EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等贵，国外上市但一代TKI耐药可用Nimotuzumab尼妥珠单抗EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等国外上市T790M耐药后可用Panitumumab帕妥珠单抗EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等国外上市T790M耐药后可用Ceritinib色瑞替尼EML4-ALK融合，ALK扩增，ROS1，MET等国外上市克唑替尼耐药后可用Alectinib-EML4-ALK融合，ALK扩增，ROS1，MET等国外上市，脑转移可用克唑替尼耐药后可用AZD9291-EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等未上市T790M突变可用CO-1686-EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等未上市T790M突变可用AUY922-EGFR,KRAS,NRAS,BRAF,PI3K,PTEN,MET,ALK,ROS1,ERBB2等未上市20外显子耐药插入可用肺癌靶向药物还有20款以上药物在国外上市或处于临床实验阶段，包括AZD9291、CO-1686等40目前靶向治疗现状（I/IV）癌种部分关联基因突变靶向药物EGFRExons18-21Erlotinib/gefitinib肺癌

EML4-­‐ALKFusionproductPF02341066ALK/c-Metinhibitor

XRCC25SNPsResponsetoplatinumagents

ERCC1mRNAexpression

RRMImRNAexpression

41现国内常见检测位点，一般为几个基因，几个位点目前靶向治疗现状（II/IV）42信号通路复杂性决定了：一代桑格测序采用的一个或几个基因检测不能准确的指导用药目前靶向治疗现状（III/IV）43美国麻省综合医院现采用的癌症检测包括236个基因的全长测序德州MDAndersonCancerCenter正在研发的检测包括近400基因如果要准确进行个性化用药，我们需要了解癌症突变全景相关基因：包括信号通路上下游基因、同一基因家族基因等目前靶向治疗现状（IV/IV）44基因的突变类型多种多样，单位点检测漏掉大量信息突变类型现常用检测方法单碱基突变（KRASG12D）PCR+桑格测序小范围碱基缺失/插入（KITV559del）PCR+桑格测序大范围碱基缺失/插入（EGFR19外显子）ARMSPCR基因扩增/表达变化（ERBB2/HER2扩增）荧光定量PCR,FISH基因融合（EML4-ALK融合）FISH高通量测序可以一次检测上面列举的所有突变类型人类基因组结构变化示图：基因突变类型多种多样通过临床新一代测序技术(NGS)揭示

基因变异高检出率以指导肺癌的靶向治疗386个肺癌FFPE标本，95%为NSCLC(367/386)通过NGS为基础的诊断性检验方法来描绘基因变异图谱检测182个癌症相关基因的3320个外显子检测肿瘤中重排频率较高的14个基因的37个内含子结果：确认1205个基因改变，平均每个肿瘤3.31个改变(0-10)85%(310)标本包含1个可作为靶点的基因改变*，平均每个标本1.79个(0-6)在68%(248)的肿瘤中，至少1个检测到的基因变异会被目前“热点”检测**所遗漏AliSM,etal.2013ASCOAbstract8020.*可作为靶点的基因改变定义为具有相应的靶向抗肿瘤药物或能够在临床研究中加以评价的基因靶点改变*

*热点检测