抗生素研发与质量控制的热点问题课件

抗生素研发与质量控制的热点问题中国药品生物制品检定所药品监管质量控制质控分析（目的）（手段）（方法）药物质控分析、质量控制与药品监管的相互关系药学分析化学（提供对象）（理论和方法）社会政治、经济发展的反映社会发展的不同时期，各种政治、经济矛盾的焦点、热点不同，进而影响药品监管政策、法规的制定及药品的监管理念。不同历史阶段的热点问题不同国内抗生素的研发现状已仿制为主，几乎所有具有较好疗效的抗生素，国内均已仿制成功。仅有少数创新品种，如β-内酰胺抗生素，仅呋苄青霉素和头孢硫米是国内上市国外没有上市的。对少数创新品种的理化及生物学特性也未作深入的研究近年来国内许多中小企业热衷于制剂的仿制，如进口分装，改剂型。对原料药热衷于改进工艺，降低成本。热衷于“独家”品种的研发。热衷于抗生素复方制剂的研发。问题：

仿制品与原发产品一致吗？

结构一致质量是否一致？制剂是否一致？疗效是否一致？近年来较为突出的新质量问题：注射用头孢曲松钠的澄清度注射用头孢拉定的血尿热不稳定抗生素输液的安全性新药研发的薄弱环节－1

忽视抗生素稳定性的研究晶型与稳定性的关系水分与稳定性的关系杂质与稳定性的关系早期抗生素的四大质量问题新药研发的薄弱环节－2

对抗生素杂质的控制工艺杂质降解杂质新药研发的薄弱环节－4

忽视制剂的质量药品与包装测量的相容性2005年的监督抽验中，发现多个企业的注射液用头孢曲松钠澄清度不合格，其原因是头孢曲松钠与丁基胶塞的相容性不好，胶塞中的残留物释放与药品相互作用形成不溶性复合物。对策加强新药审批中的技术要求，促使企业在新药的研发阶段完成新药的基础研究；利用单独定价等手段，鼓励企业开展研究，提高已上市品种的质量。现代分析技术对抗生素分析的影响抗生素药品的特点纯度一般较化学药品低

发酵类产品通常为多组分且活性组分易发生变异

稳定性一般较化学药品差结构较一般化学药品复杂

与药品质量控制密切相关的分析仪器各类色谱仪器的自动化程度越来越高各类色谱仪器越来越专业化凝胶色谱，离子色谱，逆流分溶色谱色谱与光谱联用技术越来越成熟HPLC－UV，HPLC－MS，HPLC－NMRGC－MS，GC－IR各类数据库越来越丰富联机智能化解析系统越来越普及国外药典抗生素各论收载的新实验技术NMR鉴别（日抗基）拉曼光谱（USP）热分析（USP）HPLC电化学检测器（USP）苯乙烯－二乙烯基苯共聚物色谱柱（EP、BP）USP26版开始，每版都有新类型的色谱柱增加，29版已增加至L62与药品质量控制密切相关的分析技术样品前处理技术样品的富集、净化（固相萃取技术）混和机理分析技术柱切换技术、混和机理分离填料色谱数据的标准化研究色谱柱的分类、保留值的校准色谱数据的解析抗生素多组分抗生素十六元环大环内酯类抗生素吉他霉素乙酰吉他霉素麦迪霉素麦白霉素乙酰螺旋霉素氨基糖苷类抗生素庆大霉素西索霉素糖肽类抗生素吉它霉素（Kitasamycin）吉他组分R1R2分子量A1HCOCH2CH(CH3)2785A3COCH3COCH2CH(CH3)2827A4COCH3COCH2CH2CH3813A5HCOCH2CH2CH3771A6COCH3COCH2CH3799A7HCOCH2CH3757A8COCH3COCH3785A9HCOCH3743A13HCOCH2CH2CH2CH2CH3799乙酰吉它霉素及其水解产物组分R1R2R3R4

分子量吉他A1

HCOCH2CH(CH3)2

HH785吉他A3COCH3COCH2CH(CH3)2

HH827A1,A3

COCH3

COCH2CH(CH3)2

COCH3COCH3911A4,A5COCH3COCH2CH2CH3

COCH3COCH3897A13COCH3COCH2CH2CH2CH2CH3

COCH3COCH3925hydro－A1,A3COCH3COCH2CH(CH3)2COCH3H897

hydro－A4,A5COCH3COCH2CH2CH3

COCH3H855hydro－A13COCH3COCH2CH2CH2CH2CH3

COCH3H883

ACA，535：89-99,2005分析化学，34（1）：95-99，2006药学学报，41（5）：475-480，2006对抗生素分析的影响多组分抗生素结构越来越清楚含量与效价的关系越来越明朗杂质的来源、结构越来越清晰质量和毒付反应当关系越来越明确目前仍主要用效价表征活性的抗生素大环内酯类抗生素氨基糖苷类抗生素糖肽类抗生素多烯类抗生素多肽类抗生素效价单位早期抗生素研发中，受分析条件的限制，无法确切测定抗生素的结构和组成，或无法得到其纯品，因此不能用重量单位来计量其活性，只能人为指定效价单位采用生物法来计量其活性。如青霉素单位也称牛津单位（Oxfordunit），最初定义是“50ml肉汤培养基中，能抑制标准金葡菌生长的最少青霉素量为1个青霉素单位(u)”。在获得青霉素G纯品后，证明青霉素G钠（C16H17N2NaO4S）0.5988g＝1u。纯品的效价测定结果2007,65,203–207庆大霉素C组分纯品效价每1mg庆大霉素C1a纯品相当于1189庆大霉素效价单位；每1mg庆大霉素C2纯品相当于987庆大霉素效价单位；每1mg庆大霉素C2a纯品相当于958庆大霉素效价单位；每1mg庆大霉素C1纯品相当于968庆大霉素效价单位。对抗生素分析的影响多组分抗生素结构越来越清楚含量与效价的关系越来越明朗杂质的来源、结构越来越清晰质量和毒付反应的关系越来越明确杂质保留时间（分钟）相对保留时间头孢泊肟2.80.11去甲氧基头孢泊肟酯异构体A21.50.84头孢泊肟酯异构体A22.90.89去甲氧基头孢泊肟酯异构体B23.50.91△3异构体23.90.93反式头孢泊肟酯A24.80.96头孢泊肟酯异构体B25.71.00反式头孢泊肟酯B26.81.04N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A32.71.27N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B+N-乙酰基头孢泊肟酯异构体A35.61.39N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B38.61.50头孢泊肟酯开环二聚体异构体A51.82.02头孢泊肟酯开环二聚体异构体B52.22.03头孢泊肟酯HPLC分析头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A，4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+△3异构体，5=头孢泊肟酯异构体B+反式头孢泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NAC-CPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B对抗生素分析的影响多组分抗生素结构越来越清楚含量与效价的关系越来越明朗杂质的来源、结构越来越清晰质量和毒付反应的关系越来越明确细菌内毒素替代热原实验异常毒性、降压物质实验基本取消有关物质的控制残留溶剂的控制高聚物的控制手性杂质的控制残留蛋白、残留核酸的控制抗生素质控标准的发展趋势化学分析逐步取代生物学分析有关物质的控制越来越严格多指标、多角度综合控制质量指标、方法越来越细化中国药典杂质分析指导原则按化学类别和特性，杂质可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。按其来源，杂质可分为：有关物质（包括化学反应的前体、中间体、副产物、降解产物等）、其他杂质和外来物质等。无机杂质对采用了钯等催化剂的合成工艺，新药研发中应采用ICP－MS测定其残留。有机挥发性杂质残留溶剂挥发性副产物工艺杂质新药研发中对合成工艺中用到的所有一类、二类溶剂及最后三步工艺中用的所有溶剂均需进行检测；对残留溶剂分析中出现的其它色谱峰应进行归属。对有关物质的控制安全保障工艺评价工艺控制含1%的杂质的产品一定比含2%的杂质的产品好吗？安全性保证的条件：杂质总类不变杂质含量低 阿莫西林胶囊有关物质的比较A企业B企业有关物质控制理念的变化PuritycontrolImpuritycontrolImpurityProfilingControl有关物质控制新理念

－利用杂质谱控制生产工艺例如头孢噻肟钠（CefotaximeSodium）是以发酵产品头孢菌素C为起始物，先经化学或酶催化反应生成7-氨基头孢烯酸（7-ACA），然后进行酰化反应生成头孢噻肟酸（CTAX），最后生成头孢噻肟钠（CTAX-Na）。由于起始物头孢菌素C含有DAO-CC、DA-CC和CC-LT等杂质，它们与头孢菌素C结构相似，所以在半合成步骤中发生相同的反应，分别生成DAO-ACA、DA-ACA和ACA-LT，进而生成DAO-CTAX、DA-CTAX和CTAX-LT等杂质头孢菌素C及其相关杂质结构根据生产工艺确定控制对象有关物质质控趋势♪

各国药典的质控重点，以多样化的检测手段（UV/ECD/ELSD/RID）力求全面控制

EP/BP：品种多，信息全（杂质结构和色谱图）

中国药典2005年版新增订有关物质：90余个

USP：增修订重点有关物质质控趋势♪梯度洗脱系统♪系统适用性试验：利用多种手段制备降解溶液、单一成分或混合成分杂质对照品（PeakIdentificationCRS)等多种方式相结合来定性。以分离度（R）为重点衡量指标。♪定量：杂质对照外标法、加校正因子或不加校正因子的主成分自身对照法，归一化法等多种方式相结合来定量。有关物质质控趋势采用不同的检测方法控制相同的项目，但规定首选方法。如阿齐霉素有关物质的控制，USP30增补中固定UV－HPLC方法为ECD－HPLC方法的替代方法，但出现争执时以ECD－HPLC方法为准。以解决方法的普及性问题。YMCC18色谱柱分析利奈唑烷有关物质采用的梯度洗脱程序梯度状态梯度时间(min)CA(%)CB(%)等度0．009010等度结束，梯度1开始2．59010梯度1结束，梯度2开始20．58020梯度2结束35．52575平衡36．59010平衡46．59010梯度洗脱系统色谱柱与流动相的调整ΔtG为梯度间隔时间(min)；F为流速(ml/min)；V0为柱死体积；ΔCB为梯度期间强溶剂B浓度的变化；S为与强溶剂和溶剂相关的参数。相同流速相同梯度变化率利奈唑胺系统适用性溶液色谱图

A，YMC常规色谱柱B.Alltech常规色谱柱C.Alltech高速色谱柱ABC选择同类型色谱柱确定目标色谱峰，本实验利奈唑烷完全洗出后结束梯度1，运行梯度2；梯度变化率（ΔCB/ΔtG）与流速均保持不变。本实验梯度1变化率为0.56%，梯度2变化率为3.67%；在FΔtG不变的前提下改变梯度间隔时间。利用网站上公布的色谱柱信息库品种:氨苄西林钠－有关物质－供试品溶液厂家:大连依利特发布时间:2005-12-0611:10:01

图谱信息：

供试品溶液的典型色谱图

色谱条件：

按照中国药典2005年版，梯度时间表无变化。

色谱柱名称：SinoChromODS-BP

色谱柱生产商：大连依利特分析仪器有限公司

柱长(mm)×内径(mm)，颗粒粒度（μm）：200mm×4.6mm，5μm

硅胶特性：

硅胶来源：

合成硅胶

硅胶纯度：

高纯硅胶碳载量（％）：15

比表面（m2/g）：300

孔径（Å）：

120

封尾基团：TMS

封尾程度：

是

键合方式：

共价键键合

适用于什么化合物分离？

亲水性样品

pH适用范围：

pH

2～8

；最高使用柱温：

60℃

供货商：大连依利特分析仪器有限公司

订购电话：0，84732301，84732302(销售部)

2（技术部）

有关物质质控理念♪必须控制（设立检查项目）♪全面检出（梯度，多方法互补）♪有效分离（分离度）♪目标明确（定性）♪准确定量（外标或校正因子）国内新药研发中对有关物质控制的误区重指标，轻方法方法的有效性与样品的现状对杂质的鉴别重视不够重视分析方法的有效性评价（氨苄西林钠/舒巴坦钠）原方法新方法杂质结构的确证方法分析杂质来源推测杂质的可能结构采用LC/MS等技术验证可能结构必要时采用反合成技术确证杂质利用LC-MS快速筛查已知杂质LC-MS质谱库的建立与应用影响LC－MS质谱库应用的因素电离方式影响化合物的裂解LC-MS的参数设置影响化合物的裂解样品中化合物的量影响质谱图与谱库中标准谱图的配备程度建立自己的标准谱库，是实现LC－MS快速、准确筛选的关键。我们目前已经建立了青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类抗生素、十六元大环内酯抗生素的LC－MS数据库。关注安全性指标高聚物的控制无菌/微生物限度的控制高分子杂质的分析方法高分子杂质控制方法化学分析免疫学分析色谱法分光法(P值法)反相模式离子交换模式凝胶色谱模式间接血凝法豚鼠PCA法凝胶色谱系统SephadexG-10凝胶色谱系统利用凝胶色谱的分子筛机制，让药物分子自由进入凝胶颗粒，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。实验证明，SephadexG-10凝胶（排阻分子量约700道尔吨）可基本保证所有β-内酰胺抗生素中的高分子杂质被排阻。SephadexG-10凝胶色谱系统典型分离图样品对照Kav=0SephadexG-10凝胶色谱系统的弱点对部分品种如碳青霉烯（美罗培南）等不宜分离对部分品种分离不完全，抗干扰能力较弱；部分品种无法实现药物分子的缔和，实现准确定量；分析时间较长；色谱柱需经常重装；对含敷料较多的口服制剂，特别是干混悬剂不宜使用不知道杂质的组成色谱峰分离不好流动相对分离结果有影响高效凝胶色谱系统TSK高效凝胶色谱系统Superdex

pipted

高效凝胶色谱系统Superdexpeptide填料为葡聚糖交联琼脂糖凝胶；TSK系列凝胶填料为亲水性多孔硅胶；二者均富含羟基，能够与溶质的极性基团如氨基产生特异性相互作用，二者的特性相当。高效凝胶色谱系统和

SephadexG-10系统的比较－对阿莫西林原料的比较分析1-5,不同聚合度的阿莫西林聚合物6,阿莫西林开环二聚体和阿莫西林闭环三聚体7,阿莫西林闭环二聚体和阿莫西林噻唑酸8,阿莫西林主峰阿莫西林在SuperdexPeptideHR色谱系统中的典型色谱图

SephadexG-10ChromatographicSystemforSeparationofHMWImpuritiesofAmoxicillinColumn:SephadexG-10Mobilephase:0.1mol/Lphosphatebuffer,pH7.0Flowrate:0.9ml/minDetection:UV254nmComparativeondifferentchromatographic

columnsystemsB1556002B1556005B1556012SephadexG-10system0.020.030.05TSK2000system

1+2=0.011+2+3=0.021+2+3+4=0.081+2+3+4+5=0.311+2=0.0061+2+3=0.021+2+3+4=0.071+2+3+4+5=0.301+2=0.011+2+3=0.021+2+3+4=0.081+2+3+4+5=0.31Superdexpeptitesystem1+2=0.0051+2+3=0.051+2+3+4=0.11+2+3+4+5=0.36

1+2=0.0021+2+3=0.031+2+3+4=0.071+2+3+4+5=0.34

1+2=0.0021+2+3=0.031+2+3+4=0.091+2+3+4+5=0.36

高效凝胶色谱系统可以解决部分SephadexG10色谱系统所不能解决的问题碳青霉烯中聚合物的分析颗粒剂等口服制剂的分析工艺考核美罗培南在SephadexG-10凝胶色谱系统中的色谱图美洛培南聚合溶液的色谱图SuperdexPeptidePE7.5色谱柱0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）流速为0.4ml/min。进样量为20μl开环二聚体（2号峰），闭环二聚体（3号峰），开环物（4号峰）

在pH9.0溶液中，开环物（5号峰）占的比例最大，开环二聚体（3号峰）和闭环二聚体（4号峰）比例相当；在pH7.0溶液中，美洛培南相对稳定，闭环二聚体占比例大；在pH5.0溶液中，二聚体含量几乎与开环物相当；在pH3.0溶液中，美洛培南几乎全部水解成开环物。

美洛培南在不同pH值环境下放置48h的色谱图高效疏水凝胶色谱系统TSKGelG2500HXL凝胶柱（填充剂为苯乙烯－二乙烯基苯共聚物）300×7.8mmi.d;流动相:含0.26％溴化锂的N,N-二甲基甲酰胺溶液；流速0.4ml/min;检测波长为280nm。高效凝胶色谱系统虽然较SephadexG-10色谱系统有了较大的进步，但色谱峰之间不能完全分离仍然是普遍的问题。解决方法：采用反相色谱系统HPLC反相色谱系统控制高分子杂质通过对指针性杂质的测定，表征药品中高分子杂质总量。对阿莫西林及阿莫西林/克拉维酸钾

复方制剂的分析阿莫西林杂质对照品典型色谱图

1，6－氨基青霉烷酸2，二酮哌嗪阿莫西林（2－S）3，二酮哌嗪阿莫西林（2－R）4，阿莫西林开环二聚体5，阿莫西林闭环二聚体6，阿莫西林闭环三聚体阿莫西林聚合溶液在SuperdexPeptideHR色谱系统中的典型色谱图1阿莫西林高聚物2－4不同聚合度的阿莫西林聚合物5阿莫西林开环二聚体和阿莫西林闭环三聚体6阿莫西林闭环二聚体和阿莫西林噻唑酸7阿莫西林主峰阿莫西林/克拉维酸钾高效凝胶色谱图

1高聚物2阿莫西林开环二聚体和闭环三聚体3重叠峰（包括阿莫西林闭环二聚体和阿莫西林噻唑酸，克拉维酸）4阿莫西林主峰阿莫西林克拉维酸钾(7:1)干混悬剂色谱图A,克拉维酸;B,阿莫西林;C,辅料;1－10有关物质（7为阿莫西林闭环二聚体）阿莫西林克拉维酸钾颗粒剂（4：1）杂质的相关性杂质保留时间（分钟）相对保留时间头孢泊肟2.80.11去甲氧基头孢泊肟酯异构体A21.50.84头孢泊肟酯异构体A22.90.89去甲氧基头孢泊肟酯异构体B23.50.91△3异构体23.90.93反式头孢泊肟酯A24.80.96头孢泊肟酯异构体B25.71.00反式头孢泊肟酯B26.81.04N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A32.71.27N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B+N-乙酰基头孢泊肟酯异构体A35.61.39N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B38.61.50头孢泊肟酯开环二聚体异构体A51.82.02头孢泊肟酯开环二聚体异构体B52.22.03头孢泊肟酯HPLC分析头孢泊肟酯有关物质分析的HPLC色谱图1=头孢泊肟，2=去甲氧基头孢泊肟酯异构体A，3=头孢泊肟酯异构体A，4=去甲氧基头孢泊肟酯异构体B+△3异构体，5=头孢泊肟酯异构体B+反式头孢泊肟酯A，6=反式头孢泊肟酯B，7=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体A，8=NAC-CPOD-PRX异构体A，9=N-甲酰基头孢泊肟酯异构体B，10=N-乙酰基头孢泊肟酯异构体B，11=头孢泊肟酯开环二聚体A，12=头孢泊肟酯开环二聚体B如何在反相色谱系统中确定聚合物色谱峰利用二维色谱技术实现凝胶色谱峰在反相色谱系统中的定位012min51015min012min51015min高分辨率的智能化两维色谱AnalysisofphosphorylatedpeptidesbyIMAC-RP-LCSeparationofunretainedfractionSeparationofretainedfractionIMACunretainedfractionIMACretainedfractionValveisinposition1Valveisinposition21stDimension

IMAC2ndDimension

onAcclaim120ABABSephadexG-10凝胶色谱系统分析青霉素钠Superdexpiptide凝胶色谱系统分析青霉素钠控制-内酰胺抗生素中的高分子杂质是安全性保障的需要针对具体品种应采用不同的分析方法，而不应仅局限在SephadexG10系统伴随着科学技术的发展，通过对指针性杂质的控制，控制药品中高分子杂质的总量是未来质量控制的发展方向无菌/微生物限度检查法药品微生物分析环境保证培养基保证无菌性检查灵敏度检查有效的方法方法验证SOP操作有效的结果可靠的结论结果判断培养基质量方法验证建立方法时验证检验方法的有效性日常工作中验证实验系统的有效性阳性对照确定药物的抗菌特性抗真菌药物抗细菌药物根据抗菌谱选择最敏感菌分别进行实验条件的筛选采用薄膜过滤法检查细菌污染状况，培养基稀释法检查真菌污染状况。采用薄膜过滤法检查真菌污染状况，培养基稀释法检查细菌污染状况。在确定条件下，用其它菌株进行再验证，证明方法的有效性优化实验条件，确定SOP。建立具有抗菌活性药物无菌/微生物限度检查法的一般流