基因工程讲义（已优化）

基因工程考点一基因工程的操作工具1．基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：体外。(3)操作水平：分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：目的基因在受体体内表达。(7)优点①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。②与诱变育种相比：定向改造生物遗传性状。2．DNA重组技术的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称：限制酶)①来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。②作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。③结果：产生黏性末端或平末端。(2)DNA连接酶①种类：按来源可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。②作用：在两个核苷酸之间形成磷酸二酯键以连接两段DNA片段。(3)载体①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。②质粒特点eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(能自我复制,有一个至多个限制酶切割位点,有特殊的标记基因))(1)限制酶与DNA连接酶的关系。提示：①限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。②限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(2)载体所具备条件的目的性。提示：条件目的性稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择(3)几种酶的比较。提示：比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键模板不需要不需要需要不需要作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子题组一考点诊断(1)切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列。(2014·高考江苏卷)()(2)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(2014·高考江苏卷)()(3)限制酶只能用于切割目的基因。()(4)DNA连接酶能将两碱基间通过形成氢键连接起来。()(5)E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。()(6)质粒是小型环状DNA分子，是基因工程常用的载体。()答案：(1)(×)(2)(×)(3)(×)(4)(×)(5)(×)(6)(√)2．下列关于载体的叙述中，错误的是()A．载体与目的基因结合后，实质上就是一个重组DNA分子B．对某种限制酶而言，载体最好只有一个切点，但还要有其他多种酶的切点C．目前常用的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒D．载体具有某些标记基因，便于对其进行切割解析：选D。标记基因的作用是便于筛选出重组载体，不是便于对其切割。3．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是()A．①②③④ B．①②④③C．①④②③ D．①④③②解析：选C。限制酶可在特定位点对DNA分子进行切割；DNA聚合酶在DNA分子复制时将脱氧核苷酸连接成脱氧核苷酸链；DNA连接酶可将限制酶切开的磷酸二酯键连接在一起；解旋酶的作用是将DNA双链解开螺旋，为复制或转录提供模板。1.限制酶是一类酶，而不是一种酶。2.限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。3.为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。考点二基因工程的操作过程及其应用1．基因工程的操作程序(1)基因工程的操作步骤①eq\x(\a\al(获取目,的基因))—eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.从基因文库中获取,b.利用PCR技术扩增,c.通过化学方法人工合成))②eq\x(\a\al(构建基因,表达载体))—组成eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.目的基因,b.启动子,c.终止子,d.标记基因))③eq\x(\a\al(将目的基因导,入受体细胞))—方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.植物：农杆菌转化法、,基因枪法、花粉管通道法,b.动物：显微注射法,c.微生物：感受态细胞法))④eq\x(\a\al(检测和,鉴定目,的基因))eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(a.利用DNA分子杂交法检测目的基因是否,插入转基因生物染色体的DNA中,b.利用分子杂交技术检测目的基因是否转录,出相应的mRNA分子,c.利用抗原—抗体杂交技术检测目的基,因是否已表达出相应的蛋白质,d.有时还需从个体水平对其生物学特定性状,进行检测))2．基因工程的应用(1)植物基因工程：主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。(2)动物基因工程：主要应用于动物品种改良、建立生物反应器、器官移植等方面。(3)基因工程药物：来源于转基因的工程菌。(4)基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能。[深度思考](1)在目的基因的获取方法上有怎样的区别？提示：直接分离法①从自然界已有的物种中分离，如从基因组文库或cDNA文库中获取。②如果需要大量增加目的基因，且目的基因的核苷酸序列仅部分已知，则利用PCR技术扩增。人工合成目的基因①如果基因比较小，核苷酸序列又已知，可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。②以RNA为模板，在逆转录酶的作用下人工合成。(2)基因表达载体的构建。提示：①基因表达载体的组成及作用：②基因表达载体的构建过程：(3)将目的基因导入受体细胞。提示：①转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。②将目的基因导入受体细胞：生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子(4)目的基因的检测与鉴定。提示：方法检测或鉴定目的水平DNA分子杂交技术检测目的基因的有无分子水平分子杂交技术目的基因是否转录抗原—抗体杂交技术目的基因是否翻译生物性状的表达与否目的基因是否表达个体水平,题组一考点诊断(1)抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达。(2014·高考江苏卷)()(2)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。(2011·高考四川卷)()(3)将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。()(4)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清白蛋白，这是因为将人的血清白蛋白基因导入了动物的乳腺细胞中。()(5)为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。()答案：(1)(√)(2)(×)(3)(√)(4)(×)(5)(×)题组二基因工程的操作过程及应用分析1．(2014·高考广东卷)(多选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列叙述正确的是()A．过程①需使用逆转录酶B．过程②需使用解旋酶和PCR获取目的基因C．过程③使用的感受态细胞可用NaCl溶液制备D．过程④可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞解析：选AD。本题考查基因工程。由mRNA获得DNA的过程是逆转录，需要逆转录酶，A项正确。过程②表示用PCR扩增目的基因，此过程不需要解旋酶，通过控制温度达到解旋的目的，B项错误。过程③感受态的大肠杆菌是使用CaCl2处理的，C项错误。鉴定目的基因是否导入受体细胞，可以采用DNA分子杂交技术，D项正确。2．(2014·高考新课标全国Ⅱ卷)植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)理论上，基因组文库含有生物的________基因；而cDNA文库中含有生物的________基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中________出所需的耐旱基因。(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物________的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的________，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的________是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为3∶1时，则可推测该耐旱基因整合到了________________(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。解析：(1)基因组文库包含某种生物的全部基因，cDNA文库又称为部分基因文库，含有生物的部分基因。(2)植物甲基因组文库中有该种植物的全部基因，从中可筛选出耐旱基因。(3)植物乙的耐旱性低，所以植物乙体细胞作为受体细胞；要确定耐旱基因是否正确表达，应检测该基因的表达产物，对于个体水平的检测，应在干旱的田间进行试验，检测植物乙耐旱性是否得到了提高。(4)将耐旱基因看作A，不耐旱基因看作a，Aa×Aa→耐旱与不耐旱数量比为3∶1，则耐旱基因整合到了同源染色体的一条上。答案：(1)全部部分(2)筛选(3)乙表达产物耐旱性(4)同源染色体的一条上基因工程操作程序易错点剖析1．基因表达载体≠载体：基因表达载体与载体相比增加了目的基因。2．目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入启动子内部，启动子将失去原功能。3．启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子：启动子和终止子位于DNA片段上，分别控制转录过程的启动和终止；起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译的启动和终止。4．切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶。如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。5．基因工程操作过程中只有第三步没有碱基互补配对现象：第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。考点三蛋白质工程及其与基因工程的关系1．流程图写出流程图中字母代表的含义：A．转录，B.翻译，C.分子设计，D.多肽链，E.预期功能。2．结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。3．应用：主要集中应用于对现有蛋白质进行改造，改良生物性状。[深度思考]蛋白质工程与基因工程的关系项目区别与联系蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造题组一蛋白质工程的分析1．(2013·高考广东卷)从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是()A．合成编码目的肽的DNA片段B．构建含目的肽DNA片段的表达载体C．依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽D．筛选出具有优良活性的模拟肽作为目的肽解析：选C。由题中信息“在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物”可推知本题考查蛋白质工程的相关知识。根据蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)，可推知答案为C。2．(2016·湖南师大附中月考)干扰素是动物体内合成的一种蛋白质，可以用于治疗病毒感染和癌症，但体外保存相当困难，如果将其分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，就可在－70℃条件下保存半年，请根据以上信息回答下列问题：(1)蛋白质的合成是受基因控制的，因此获得能够控制合成“可以保存的干扰素”的基因是生产的关键，依据蛋白质工程原理，设计实验流程，让动物生产“可以保存的干扰素”。写出下列方框中相应实验步骤。①____________________，②____________________，③____________________，④____________________。(2)基因工程与蛋白质工程相比较，基因工程在原则上只能生产__________的蛋白质，不一定符合__________需要。而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过__________或________，对现有蛋白质进行__________，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需要。(3)蛋白质工程实施的难度很大，原因是蛋白质具有十分复杂的__________结构。解析：蛋白质工程的操作流程是：预期蛋白质的功能→预期蛋白质结构→推测氨基酸序列→确定相对应的脱氧核苷酸序列。基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程却可以生产自然界不存在的蛋白质。蛋白质工程直接操作的对象是基因。答案：(1)预期蛋白质的功能预期的蛋白质结构应有的氨基酸序列相对应的脱氧核苷酸序列(基因)(2)自然界已存在人类生产和生活基因修饰基因合成改造(3)空间(或高级)题组二蛋白质工程与基因工程的关系分析3．(2015·高考全国Ⅱ卷)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________和________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。解析：(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。中心法则的内容如下图所示：由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。答案：(1)氨基酸序列(或结构)(2)PP1DNA和RNA(或遗传物质)DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)(3)设计蛋白质的结构推测氨基酸序列功能1．(2012·高考新课标全国卷)根据基因工程的有关知识，回答下列问题：(1)限制性内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：AATTC……GG……CTTAA为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切酶切割，该酶必须具有的特点是_______________________________________________。(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。(4)反转录作用的模板是________，产物是________。若要在体外获得大量反转录产物，常采用________技术。(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是______________________________________________________________________________________________。解析：此题考查基因工程应用的相关知识。(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连，应使二者被切割后产生的末端相同，故用另一种限制酶切割产生的末端必须与EcoRⅠ切割产生的末端相同。(3)根据酶的来源不同，DNA连接酶分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。(4)以RNA为模板，合成DNA的过程称为逆转录，若要体外获得大量DNA分子，可以使用PCR技术。(5)在基因工程中，通常利用质粒作为运载体，另外噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞时，常用Ca2＋处理，使之成为能吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。答案：(1)黏性末端平末端(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同(其他合理答案也可)(3)大肠杆菌T4(4)mRNA(或RNA)cDNA(或DNA)PCR(5)噬菌体动植物病毒(其他合理答案也可)(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱(其他合理答案也可)2．(2015·高考海南卷)在体内，人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链，此肽链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原，进入高尔基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后，产生A、B两条肽链，再经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前，利用基因工程技术可大量生产胰岛素。回答下列问题：(1)人体内合成前胰岛素原的细胞是________，合成胰高血糖素的细胞是________。(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的________序列，用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载体，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成________的基因工程菌。(3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，则用该工程菌进行工业发酵时，应从________中分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。解析：(1)人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛B细胞，合成胰高血糖素的细胞是胰岛A细胞。(2)蛋白质工程生产胰岛素时，需根据胰岛素原的氨基酸序列，设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因)，然后再构建胰岛素原基因重组表达载体，导入细菌细胞内，再经过细菌转化、筛选及鉴定，即可建立能稳定合成胰岛素原的工程菌。(3)运用抗原—抗体检测法检测胰岛素原时，培养液无抗原抗体反应，菌体有抗原抗体反应，故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。答案：(1)胰岛B细胞胰岛A细胞(2)DNA胰岛素原(3)菌体2.在某些深海鱼中发现的抗冻蛋白基因afp对提高农作物的抗寒能力有较高的应用价值。如图所示是获得转基因莴苣的技术流程，请据图回答下列问题：(1)获取目的基因的主要途径包括从自然界已有的物种中分离和________。(2)①过程需要的酶有__________________、________。(3)重组质粒除了带有抗冻蛋白基因afp以外，还必须含有启动子、终止子和________________，这样才能构成一个完整的基因表达载体。(4)如果受体细胞C1是土壤农杆菌，则将目的基因导入它的目的是利用农杆菌的________，使目的基因进入受体细胞C2，并将其插入到受体细胞C2中的________上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，形成转基因莴苣。经②过程获得的转基因莴苣中的目的基因是否表达，在分子水平上可用________法进行检测，如果出现杂交带，说明目的基因已经表达蛋白质产品，转基因莴苣培育成功。解析：(1)获取目的基因的主要途径有从自然界已有的物种中分离和人工合成。(2)①过程为基因表达载体的构建过程，需要用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(3)一个完整的基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。(4)农杆菌转化法利用的是农杆菌的转化作用，将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上，进而使目的基因能够稳定遗传和表达。检测目的基因是否成功表达可采用抗原—抗体杂交法。答案：(1)人工合成(2)限制性核酸内切酶DNA连接酶(3)标记基因(4)转化作用染色体DNA抗原—抗体杂交3．(2016·潍坊模拟)胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射入人体后，会堆积在皮下，要经过较长时间才能进入血液，而进入血液的胰岛素又容易分解，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计的速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是________。(2)图中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是______________________________________________________________________________________________。(3)新的胰岛素基因与载体(质粒)结合过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。已知限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—。请画出质粒被限制性核酸内切酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端：________。DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？________(填“是”或“否”)。(4)若将含有新的胰岛素基因的表达载体导入植物细胞中，最常用的方法是________。(5)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有________、________和发酵工程。解析：(1)构建新的胰岛素模型的主要依据是蛋白质的预期功能。(2)根据蛋白质的预期功能，推测新的胰岛素中氨基酸的序列，进而推断基因中的脱氧核苷酸序列来合成新的胰岛素基因。(3)将目的基因导入植物细胞中，最常用的转化方法是农杆菌转化法。(4)限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，产生特定的黏性末端或平口末端，而DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列却没有专一性要求。(5)生产自然界中本来没有的蛋白质需要用到蛋白质工程、基因工程等技术。答案：(1)蛋白质的预期功能(2)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成新的胰岛素基因(3)eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(—G,—CCTAG))eq\b\lc\\rc\(\a\vs4\al\co1(GATCC—,G—))否(4)农杆菌转化法(5)蛋白质工程基因工程4．(2016·河北唐山一中期中)如图是从酵母菌获取某植物需要的某种酶基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：(1)图中cDNA文库__________基因组文库(填“大于”“等于”或者“小于”)。(2)①过程提取的DNA需要__________的切割，B过程是__________。(3)为在短时间内大量获得目的基因，可用__________扩增的方法。目的基因获取之后，需要进行________，其组成必须有________________以及标记基因等，此步骤是基因工程的核心。(4)将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是__________，其能否在此植物体内稳定遗传可以用________技术进行检测。解析：(1)cDNA文库小于基因组文库。(2)提取目的基因需要限制酶，逆转录法获得目的基因需要逆转录酶。(3)短时间内大量获得目的基因，可用PCR技术扩增的方法。基因表达载体的组成必须有目的基因、标记基因、启动子和终止子，基因表达载体的构建是基因工程的核心。(4)将目的基因导入某双子叶植物细胞常采用的方法是农杆菌转化法，目的基因只有整合到植物细胞的染色体上才能在植物体内稳定遗传，可通过DNA分子杂交的方法对目的基因是否整合到染色体上进行检测。答案：(1)小于(2)限制酶反转录(或逆转录)(3)PCR技术基因表达载体的构建启动子、终止子、目的基因(4)农杆菌转化法DNA分子杂交6．(2014·高考天津卷)嗜热土壤芽孢杆菌产生的β－葡萄糖苷酶(BglB)是一种耐热纤维素酶，为使其在工业生产中更好地应用，开展了利用大肠杆菌表达BglB酶的试验：(1)PCR扩增bglB基因时，选用__________基因组DNA作模板。(2)右图为质粒限制酶酶切图谱。bglB基因不含图中限制酶识别序列。为使PCR扩增的bglB基因重组进该质粒，扩增的bglB基因两端需分别引入________和________不同限制酶的识别序列。注：图中限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。(3)大肠杆菌不能降解纤维素，但转入上述构建好的表达载体后则获得了降解纤维素的能力，这是因为________________。解析：本题考查了基因工程及影响酶活性的因素。(1)bglB基因存在于嗜热土壤芽孢杆菌中，所以为扩增bglB基因，应选用嗜热土壤芽孢杆菌基因组DNA做模板。(2)用限制酶切割时，不能破坏质粒中的复制原点、启动子、终止子及标记基因(如抗生素抗性基因)，而且要将目的基因插入启动子和终止子之间，NdeⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ符合条件，而XbaⅠ的酶切位点在质粒中有两处，这样会影响目的基因插入的准确性，所以应选择NdeⅠ和BamHⅠ。目的基因的黏性末端应与质粒相同，所以扩增的bglB基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ不同限制酶的识别序列。(3)导入目的基因后的大肠杆菌具有分泌BglB酶的能力，即可以降解纤维素。答案：(1)嗜热土壤芽孢杆菌(2)NdeⅠBamHⅠ(3)转基因的大肠杆菌分泌出有活性的BglB酶第2讲细胞工程[最新考纲]1．植物的组织培养(Ⅱ)2.动物的细胞培养与体细胞克隆(Ⅰ)3.细胞融合与单克隆抗体(Ⅱ)考点一植物细胞工程1．细胞工程(1)操作水平：细胞水平或细胞器水平。(2)目的：按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品。2．植物细胞的全能性(1)概念：具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。(2)物质基础：细胞内含有本物种全部的遗传信息。(3)体内细胞全能性不表达的原因：基因在特定的时间和空间条件下选择性表达，形成不同的组织、器官。3．植物组织培养技术(1)原理：细胞的全能性。(2)概念理解eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(培养对象：离体的植物器官、组织、细胞,培养条件：无菌、人工配制的培养基、,相关激素等,培养结果：产生愈伤组织、丛芽，最终形成,完整植株))(3)操作流程；外植体eq\o(→,\s\up7(脱分化))愈伤组织eq\o(→,\s\up7(再分化))根、芽或胚状体→试管苗。4．植物体细胞杂交技术(1)概念：将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。(2)操作流程：①过程①为去除细胞壁获得具有活力的原生质体，常用方法是酶解法，所用到的酶是纤维素酶和果胶酶。②过程②是原生质体的融合，人工诱导的物理法包括离心、振动、电激等；化学法一般用聚乙二醇(PEG)作为诱导剂。③过程③是原生质体融合后再生出细胞壁，这是原生质体融合成功的标志。④植物体细胞杂交的意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。5．植物细胞工程的实际应用(1)植物繁殖的新途径：①微型繁殖：用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术。②作物脱毒：选取作物无毒组织(如茎尖)进行组织培养，获得脱毒苗的技术。③人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等为材料，经过人工薄膜包装得到的种子。(2)作物新品种的培育：单倍体育种和突变体的利用。(3)细胞产物的工厂化生产：如人参皂甙干粉的生产。[深度思考](1)植物组织培养和植物体细胞杂交的比较。提示：名称植物组织培养植物体细胞杂交原理细胞的全能性细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性过程选材选取根尖、茎尖、形成层部位最容易诱导脱分化不同种的植物细胞的叶片、根尖等部位，也可从组织培养产生的愈伤组织中获得技术操作脱分化、再分化等除脱分化、再分化外，还要用酶解法去除细胞壁，用一定的方法诱导细胞融合关系植物组织培养是植物体细胞杂交的基础，植物体细胞杂交所用的技术更复杂(2)植物体细胞杂交获得的杂种细胞需要筛选吗？为什么？提示：植物体细胞杂交获得的杂种细胞的类型有三种(以上图为例)：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要进行筛选。(3)若一植物细胞含有2X条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，另一植物细胞含有2Y条染色体，2个染色体组，基因型为ccDd，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为2X＋2Y，基因型为AabbccDd。题组一考点诊断(1)棉花根尖细胞经诱导形成幼苗能体现细胞全能性。()(2)植物的每个细胞在植物体内和体外都能表现出细胞的全能性。()(3)在诱导离体菊花茎段形成幼苗的过程中，不会发生细胞的增殖和分化。()(4)愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的。()(5)利用物理法或化学法，可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。()(6)用纤维素酶和果胶酶水解获得的植物原生质体失去了全能性。()(7)再生出细胞壁是原生质体融合成功的标志。()答案：(1)(√)(2)(×)(3)(×)(4)(×)(5)(×)(6)(×)(7)(√)题组二植物组织培养与植物体细胞杂交过程的分析1．某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。下列有关叙述，错误的是()A．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害B．在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞C．出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控D．生根时，培养基通常应含α－萘乙酸等生长素类调节剂解析：选B。本题主要考查植物组织培养的相关知识。在愈伤组织中，因植物细胞含有细胞壁，阻碍了细胞融合，所以此时加入细胞融合的诱导剂，不能获得染色体加倍的细胞；消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害；愈伤组织出芽是细胞分化的结果，而细胞分化的实质是基因的选择性表达；生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素，生根时，培养基通常含有α－萘乙酸等生长素类调节剂。故B项错误。1．细胞全能性大小的比较植物细胞：受精卵>生殖细胞>体细胞动物细胞：受精卵>生殖细胞>胚胎干细胞>体细胞核(动物细胞全能性受限制，但细胞核具有全能性)2．植物激素在植物组织培养中的作用生长素/细胞分裂素的比值作用效果比值高时促进根分化、抑制芽形成比值低时促进芽分化、抑制根形成比值适中促进愈伤组织形成3.由于植物分生区附近(如茎尖)的病毒极少，所以常采用茎尖组织培养技术获得脱毒苗。考点二动物细胞培养和体细胞克隆1．动物细胞培养(1)操作流程：动物组织块eq\o(→,\s\up18(剪碎),\s\do15(胰蛋白酶或胶原蛋白酶))单个细胞的悬浮液eq\o(→,\s\up15(转入培养瓶))原代培养eq\o(→,\s\up13(分瓶))传代培养(2)培养条件：①无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，添加抗生素，定期更换培养液以消除代谢产物。②营养：除正常的有机和无机营养外，加入血清、血浆等一些天然成分。③适宜的温度和pH：温度为36.5±0.5℃(哺乳动物)，pH为7.2～7.4。④气体环境：含95%空气加5%CO2的混合气体，其中后者的作用是维持培养液的pH。(3)应用：生物制品的生产，检测有毒物质，医学研究。2．动物体细胞核移植技术和克隆动物(1)动物核移植：将动物一个细胞的细胞核移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。(2)过程：重组细胞eq\o(→,\s\up13(发育))重组胚胎eq\o(→,\s\up18(胚胎移植))代孕母体→生出与供体遗传物质基本相同的个体(3)原理：动物体细胞核具有全能性。(4)结果：获得与供体遗传物质基本相同的个体。(5)克隆动物：用核移植方法得到的动物。[深度思考](1)动物细胞培养与细胞核移植的比较。提示：项目动物细胞培养动物体细胞核移植原理细胞增殖动物细胞核的全能性关键环节细胞增殖和癌变细胞核移植、细胞分化结果相同分化程度的细胞群获得克隆动物应用①生产生物制品②医学研究③检测有毒物质①加速良种繁育②保护濒危物种③生产医用蛋白④作为异种移植的供体⑤用于组织器官的移植(2)动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用有什么不同？提示：第一次用胰蛋白酶处理剪碎的组织使之分散成单个细胞，第二次使贴壁细胞从瓶壁上脱落下来。(3)在细胞核移植过程中卵母细胞选择时期及原因分别是什么？提示：卵母细胞选择时期及原因：MⅡ中期的卵母细胞，此时具备受精能力，细胞质中合成与分裂、分化有关的物质能刺激融合后重组细胞进行分裂分化，形成重组胚胎。(4)核移植产生的克隆动物与提供细胞核的亲本完全相同吗？提示：可能不同，①克隆动物细胞质基因来源于另一个亲本，与植物组织培养不同(来自一个亲本)，即克隆动物遗传物质来自两个亲本。②在发育过程中可能发生基因突变、染色体变异导致性状改变。③外界环境条件的影响引起不可遗传的变异。题组一考点诊断(1)在25℃的实验条件下可顺利完成大鼠神经细胞的培养。(2014·高考北京卷)()(2)动物细胞培养技术可用于转基因动物的培育。(2011·高考江苏卷)()(3)培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞。(2010·高考浙江卷)()(4)克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变。(2010·高考浙江卷)()(5)二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的。(2010·高考浙江卷)()(6)动物细胞核移植的受体细胞必须是卵细胞。()答案：(1)(×)(2)(√)(3)(×)(4)(×)(5)(×)(6)(×)题组二动物细胞培养与体细胞核移植的过程分析1．(2016·江苏镇江期末)下列有关动物细胞培养的叙述正确的是()A．动物细胞培养要经过脱分化和再分化过程B．培养基中通常要加入动物血清C．组织细胞分化程度越高，培养越容易D．传代培养时可用胃蛋白酶分散细胞解析：选B。理解动物细胞培养的过程是解题关键。动物细胞培养不需要脱分化；一般来说，组织细胞分化程度越低，增殖能力越强，培养越容易；原代培养和传代培养时都要用胰蛋白酶把组织细胞分散开。2．科学家通过转基因技术获得了含有人生长激素基因的奶牛，如果要加速转基因奶牛的繁育，可以对此转基因奶牛进行克隆(如图所示)。请结合图示回答下列问题：(1)在进行细胞培养时，要对取自转基因奶牛的组织细胞进行分散处理，形成单个细胞，这个过程中需要利用________酶处理。(2)用于核移植的供体细胞，一般都选用传代10代以内的细胞，原因是_______________________________________________。(3)在进行原代培养时，细胞增殖的方式是________，此外，细胞增殖还表现出________和接触抑制等特点。(4)将进行培养的供体细胞注入去核的卵母细胞中，去除卵母细胞核的目的是_______________________________________________。(5)将重组细胞在培养液中培养形成的重组胚胎移入受体母牛后，该母牛就会生出与供体奶牛遗传物质相同的犊牛，但也不是100%地复制，原因最可能是______________________________________________________________________________________________。(6)上述动物工程中涉及的技术有_______________________________________________。转基因牛的克隆成功，说明了动物________具有全能性。答案：(1)胰蛋白(2)该种细胞代谢旺盛、分裂能力强，且遗传物质没有发生改变(3)有丝分裂贴壁生长(4)使克隆出的动物个体的遗传物质几乎全部来自供体细胞(5)生物的性状受细胞核基因和细胞质基因的共同控制；生物的性状还受环境因素的影响(6)核移植、细胞培养、胚胎移植技术体细胞的细胞核1.细胞核移植技术形成重组细胞并发育成一个新个体，体现了细胞核的全能性而非动物细胞的全能性。2.克隆属于无性繁殖，产生新个体的性别、绝大多数性状与供核亲本一致。考点三动物细胞融合与单克隆抗体的制备1．动物细胞融合(1)原理：细胞膜的流动性。(2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。(3)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。2．单克隆抗体的制备(1)制备过程：(2)优点：特异性强、灵敏度高，并可大量制备。(3)用途：作为诊断试剂，用于治疗疾病和运载药物。[深度思考](1)植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较：提示：比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞的增殖融合前处理除去细胞壁使细胞分散开使用的酶纤维素酶和果胶酶胰蛋白酶诱导手段物理法：离心、电激、振动化学法：聚乙二醇等试剂诱导除物理法和化学法外，也可用灭活的病毒诱导结果杂种植株杂交细胞应用培育植物新品种主要用于制备单克隆抗体意义突破远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合相同点原生质体融合原理相同，原生质体融合的方法相似(2)单克隆抗体制备过程的几个问题分析。提示：①对动物免疫的原因：B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以，与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。②在单克隆抗体制备过程中，一般认为有两次筛选过程，第一次是筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基)，第二次是进一步筛选出能产生人们所需要抗体的杂交瘤细胞。③杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质，不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力，还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力，从而可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点，而大量生产单克隆抗体。题组一考点诊断(1)可以用灭活的病毒促进动物细胞融合，而不能促进植物细胞融合。()(2)小鼠骨髓瘤细胞染色体数为40，B淋巴细胞的染色体数为46，融合后形成的杂交瘤细胞DNA分子数为86。()(3)杂交瘤细胞进行体内培养，是为了获得能产生单克隆抗体的胚胎。()(4)体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体。()(5)B淋巴细胞和骨髓瘤细胞经细胞融合后有三种细胞类型(若仅考虑两两融合的情况)。()答案：(1)(√)(2)(×)(3)(×)(4)(×)(5)(√)题组二动物细胞融合与单克隆抗体制备过程的分析1．与植物体细胞杂交相比，动物细胞融合的原理及其特有的诱导因子分别是()A．细胞膜的流动性、离心B．细胞膜的流动性、灭活的病毒C．细胞的全能性、电激D．细胞的全能性、灭活的病毒解析：选B。植物体细胞杂交的原理是细胞膜的流动性、细胞的全能性，动物细胞融合的原理是细胞膜的流动性；动物细胞融合的常用诱导因子有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等，其中灭活的病毒是其特有的诱导因子，而聚乙二醇、电激均可用于诱导植物体细胞杂交。制备单克隆抗体过程中的两次筛选项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞1．(2013·高考新课标全国Ⅱ卷)甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。回答下列问题：(1)为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的________，再用化学诱导剂诱导二者融合。形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成