三七提取物深加工制备中药药物方法应用工艺专利技术文集皂苷r1的用途

(19)(19)民国家知局(21)(22)

(10)申请公布号CN(43)(71)申请人师范大地址100875市海淀区新街口外大19申请人师大科技园科技发展(72)发明人(74)专利机构集佳知识有公司A61K31/704A61P25/28权利要求权利要求书1页说明书18页序列表1页附图9页(57)A的用途。本发明通过实验证明NTR1可改善APP/PS1转AD小鼠的认知与学习能力，回复其脑内ChAT水平，降低脑内丙二醛水平，通过提高CcO活性，从而提高AD小鼠线粒体功能。并且，NTR1还可以提高IDE从而促进Aβ的降解七皂苷R1在治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。并且通过实证实三七皂苷R1在0μmol/L～500μmol/L的浓度范围内对细胞活性ACN

权利要求 1/1脂脂 中的主要有效成分是三七总皂苷(PanaxNotoginsengSaponinsPNS)包括多种单体皂苷，R1NTR1如式I所示，[0004]，NTR1[0005]190NTR1究。研究称NTR1在多种血管相关细胞具有促进纤维蛋白溶解系统合成的作其作用机制可能是通过对内皮细胞E-选择素和中性白细胞CD18蛋白表达的抑制。另一项研究表NTR1可在细胞水平通过抑ERK以及NADPH氧化酶介导ROS生成TNF-a抑制人全血细胞培养中LPS引起的TNF-a的升高。的研究发在脂多糖诱导的心脏功能小鼠模型中，NTR1可抑制NF-κB通路的炎症因子减轻心肌的炎症反应和细胞凋亡。这一作用可能是通过上调了雌激素受体a（ERa）PI3K/Akt通路。 的花费约占到全球GDP总值的1%。阿尔茨海默病(Alzheimer`sDisease,AD)， 等。AD的病因十分杂，其发病机制目前尚不明确。ADplaque,SP 本发明提供了三七皂苷R1在促进ChAT或CcO活性及表达水平中的应用。 ChAT切相关的神经递质乙酰胆碱水平降低会导致学习功能。CcO即细胞色素C氧化NTR1 [0014]丙二醛（MDA是细胞氧化应激的产物，可作为氧化应激水平的标志物。本发明通过实验证NTR1能够剂量依赖性的降低APP/PS1小鼠皮层内MDA水平NTR1可降低APP/PS1小鼠的氧化应激水平。[0016]NTR1能够剂量依赖性APP/PS1小鼠皮层内线CcO活性CcO处N2a-APP695sw细胞IDE蛋白NTR1浓度梯度NTR1处理神经元剂量依赖地促进神IDE蛋白的表达。动物实验表明，NTR1能够提高APP/PS1小鼠脑皮层内IDE的mRNA及蛋白水平。从而证R1能够促进细胞或组织中IDE的表[0019]本发明还提供了三七皂苷R1在Aβ降解促进剂或Aβ积累抑制剂中的应用。[0020]Aββ4042AD的成分具有神经细胞毒性是AD致病因一。由APP蛋白经β-分泌酶和γ-分（IDE（NEPN2a-APP695sw胞外分泌的Aβ1-40和Aβ1-42水平。AD小鼠的认知与学习能力回复其脑内ChAT水平降低脑内丙二醛水平通过提高CcO活性，从而提AD小鼠线粒体功能。并且，NTR1还可以提IDE水平，从而促Aβ的降解并抑制Aβ的积累。因此本发明进一步提供了三七皂苷R1在治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。并且通过实验R1在0μmol/L～500μmol/L的浓度范围内对 申组1～5天隐蔽平台逃避潜伏期5示正常对1～5天隐逃避潜伏期变化

（P<0.05，

避潜伏期变化；3（b3（d 4（d）NTR1APP/PS1ChAT 层ChAT的Westernblot检测显影图，图5（b示以GAPDH为对照各组小鼠皮层中ChAT

（P<0.05，

，小鼠皮IDE蛋白Westernblot检测显影图，图6（b）示β-actin为对照各组小鼠皮层中IDE蛋白的相对含量示与模型对照组相比存在显著性差（P<0.05）；，，IDEmRNArtPCR产物的7（b）示β-actin为对照各组小鼠皮IDEmRNA，相对表达量

示与模型对照组比较存在显著性差 示与模型对照组NTR1APP/PS1Aβ，[0035]9示不同浓NTR1N2a-APP695swPPARγp-PPARγ蛋白水平的影9（a示经不同浓NTR1处理的N2a-APP695sw细胞中PPARγp-PPARγ及对照β-actinwesternbolt显影图，图9（b示以β-actin为对照同浓度NTR1处N2a-APP695sw细胞PPARγ相对9（c）示β-actin照，经不同浓度NTR1N2a-APP695swp-PPARγ相对含量示与未加NTR1，在显著性差 示与未加NTR1处理的细胞相比存在极显著性差（P<0.01 图10NTR1N2a-APP695swERK1/2p-ERK1/2ERK1/2

11NTR1N2a-APP695swIDE显影图图 b，，

，，1（aIDE相对含量示与未加NTR1处理的细胞相比存在显著性差（P<0.05）示与未加NTR1（P<0.01。，，究所，2月龄，雄性（证号：SCXK(京)2005-0013。APP/PS1转AD模型小鼠为具有APP和PS1双突变的小过量生成Aβ是常见的AD小鼠模型之，3月龄出现学习功能5月龄出现老年斑。小鼠饲养于师范大学教育部天然药物功能中心SPF级动物（实验动物使用证号：SYXK（京）2009-0010。本研究动物实验通过师范大[0044]克隆胎牛购自PAA公司 HumanAβ40ELISAKit和HumanAβ42ELISAKitInvitrogen[0047]3KDaMillipore DMEM（HGIBCOERK1/2p-ERK1/2抗体购于Abcam公司。胆碱乙酰转（ChAT）抗体磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）SantaCruzBiotechnology[0051]NTR1购于泽朗科技，纯度>98%，批号ZL RIPA 80%。123APP/PS1小鼠随机分为5每组10只。分别为对照组安理申阳性对照组NTR1低剂量组、NTR1高剂量组以及C57正常对照组5组小鼠每天同一时间进行灌胃给灌胃4个月7月龄进行行为学评价和AD神经损伤相关指标的检测。各组处理给药剂量如表1所示：[0063]表1各组小鼠给药剂量 [0066]水迷宫位于SPF动物房内。水迷宫直径120cm，隐蔽平台直径10cm，头挂于水迷宫上方。室内光线不直射水面22±1钛白粉染成不透明白色；秒未找到平台引导其找到平同样停留15之后将其轻柔地取出放回笼内。小鼠找到隐蔽平台的时间即为逃避潜伏期（Escapelatency。 T-testp<0.052 （9.10±1.04s在掌握测试内容及平台位置上始终显得迟钝，具有认知/，表现为第五天的逃避潜伏期仍大于30s（31.26±5.41s。而低剂量和高剂量的NTR1均显著缩短了APP/PS1小鼠的逃避潜伏期，第五天时它们的逃避潜伏期（17.03±2.87s，13.28±1.99s）接近阳性对照安理申组（14.05±2.16s表现出很强的改善学习水中均表现出改善水平的作用。比起APP/PS1模型组小鼠，NTR1低剂量和高剂量的原（1.50±0.27vs2.50±0.342.70±0.40（24.50%±3.16%vs29.76%±3.6436.71%±4.26%使APP/PS1小鼠的空间认知/学习能力得到改善。 （12h（12h（12h（12h次)脱水。脱水在4℃进行。 30min15min液继续透明15min至外层组织呈半透明状态。透明在4℃进行并应避免透明过渡。 组织浸蜡将透明后的组织用吸水纸吸掉过多的二甲苯放入熔化的石蜡中在65℃温箱中放置2h～3h。 37℃温箱中烤片24h以上。 15min2100醇各15min295乙醇15min80705010min3份蒸馏水各3min。20min3min。35min。用滤纸吸干液体，用组化笔圈组织。Triton10（0.5%37℃温箱中30min。 盒4℃孵育过夜第二天从湿盒中取出置染缸中用PBS洗三次每次5min滤纸吸干 二抗/三抗反应按试剂盒说明书操作。 中10min，然后浸泡于蒸馏水中。 3s 5min3min 37℃干燥。 3ChATWestern[0098]样品（TrispH6.82%SDS10DTT0.1WesternBlot（10020mn160V0min（295mA90minChA（1:200GAPD（1:200）置摇4℃孵育过夜 旋震荡15s。4℃3000g离心20min取上清液。BCA法测定样品蛋白浓度后稀释至50μg/ml。之后按照说明书进行操作至显色用紫外分光光度（岛津UV-2450）532nm波OD532值。预冷的分（试B）匀浆，然41500g10min。取上10000g离 HclpH7.0120ma10s1min。空白对照值是用不含线粒体的体系测得。 T-testp<0.05为差异显著性。 棕色为阳性（标尺为40μM）；小鼠皮层ChAT的Westernblot结果如图5（A）所示，CcOMDA3 从免疫组化结果中可以看出7月龄的C57小鼠皮层上有丰富的表明C57小鼠皮层的ChAT处于较高水平而同龄的APP/PS1小鼠脑切片中只有零星的说明其皮NTNNTR1小鼠皮层内ChAT水平对APP/PS1小鼠脑内胆碱能神经元损伤具有一定的保护作用。 APP/PS1vs3.60±0.09nmol/mgmg2.82±0.08nmol/mg。说明NTR1可降低APP/PS1小鼠整体的氧化应激水平。 线粒体CcO活性检测结果表明，APP/PS1小鼠皮层线粒体CcO活性显著降低（0.27±0.01μmol/mg/minC57（0.68±0.01μmol/mg/min）的40高剂量的NTR1大幅提高了APP/PS1小鼠CcO（0.41±0.02μmol/mg/min具有显著性差异。[0126]以上结果说明，NTR1CcO 采用Westernbolt的方法分析实施例2中冻存的经水迷宫实验的小鼠皮层组织内的IDE蛋白含量并用rtPCR的方式对小鼠皮层内IDEmRNA的表达情况进行分析。 1小鼠皮层IDE蛋白的Westernblot 样品蛋白酶抑制剂和1%蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液200μL电动匀浆器冰浴匀浆行超（功21。于4℃低温离心12000rpm10min取上清BCA测定蛋白浓度并用裂解液调齐蛋白浓度。加入与样品等体积的2×LoadingBuffer（20mMTrispH6.82%SDS10甘油0.1MDTT0.1%溴酚蓝置于100℃金属浴中5min。-20℃冻存以备后续Western实验使用。WesternBlot（10020mn160V0min（295mA90minIDE（1:500β-置摇4℃孵育过夜IRDye800CW（1:10000（. [0147]RNApreppureRNARNA。具体操作如下，从-80℃冰箱中取出冻存的皮层组织样入干净EP管中个样品中加入300μL裂（含1%β-巯基乙醇。置于冰用电动匀浆机进行可见组织块为止。再加入590μLRNase-freeddH2O10μL蛋白酶K56℃孵育20min12000rpm离心5min取上清0.5倍上清体积无水乙醇，混匀。将此溶液加入吸附柱中，12000rp离心1min附柱中加入350μL12000rp离心1min再加入80μLDNase15min。加500μL漂洗液室温2min12000rp离心1min。此步骤重复一次。12000rpm离心2min打开吸附柱其彻底晾干。将吸附柱转至干净RNase-freeEP管中，加入50μLRNase-freeddH2O室温放置2min12000rpm离心2min。得到的RNA溶液-80℃保存。[0148]RNARNAOD260nm/OD280nm=OD260nm×40[0149]RT-PCR[0150]RevermoFirstStrandcDNASynthesisKit（ThermoRNARNA1μ12μL。65℃5min。再PCR管中加入其它反应4μL5×ReactinBuffer，inhibitor(20U/μL2μL10mMMix1μL42℃60mi5m后的cDNA可-20℃保存。[0151]IDEPCRPCR 1μL5μL2×TaqPCRMix（天根公司[0160]（mean±S.E.）SPSS13.0T-testp<0.0576大幅降低了一倍左而经NTR1灌胃处理后的APP/PS1小鼠的IDE出现了（升高约60%。说明NTR1提高了IDE的蛋白水平。进一步地，RT-PCR（图7APP/PS1小鼠皮层内IDEmRNA水平降NTR1低、高剂量（P0.05）提高IDEmRNA水平。该结果与IDEWesternblot结果相一致。说明NTR1可调节APP/PS1小鼠皮层内IDE的 实施例4三七皂苷R1对APP/PS1转AD模型小鼠脑内Aβ积累的影响 通过免疫组化分析ELISA实施例2中冻存的经水迷宫实验的小鼠脑组织中Aβ40及Aβ42的含量。 15min2100醇各15min295乙醇15min80705010min3份蒸馏水各3min。20min3min。35min。用滤纸吸干液体，用组化笔圈组织。Triton10（0.5%37℃温箱中30min。 盒4℃孵育过夜第二天从湿盒中取出置染缸中用PBS洗三次每次5min滤纸吸干 二抗/三抗反应按试剂盒说明书操作。 5min3min 37℃干燥。 ImageJ软件进行斑块数量和面积的分析。结果如表4所示。 84.81802020.125%±0.013% pH8.1600KCl0.2g/LKH2PO48.0g/LNaCl1.150g/L5%BSA0.003%Tween- AβELISAHμManAβ40ELISAKit和HμManAβ42ELISAKitAβ平。具体操作如下： DiluentBuffer 0pg/mL7.81pg/mL15.62pg/mL31.25pg/mL62.5pg/mL125pg/mL250pg/mL500pg/mL 0pg/mL15.62pg/mL31.25pg/mL62.5pg/mL125pg/mL250pg/mL500pg/mL1000pg/mL 50μLAβ1-40或Aβ1-42检测一抗（Aβ40/Aβ42DetectionAntibody。4℃放置过夜。在纸上扣板以尽量除去漂洗液。重复漂洗5次。应30min。]nzidine(TMB)。将孔板放置于水平摇避光显色10～30min。显色至各浓度的标准品Solution的相OD450nmAβ40Aβ42（pg/mL）为横坐标OD450nm值为纵坐标制作标准曲线。由各样品OD450nm值，根据标准曲Aβ40与Aβ42的水（pg/mL。此结果再除以各样品的蛋而得mg蛋白样品中所含有的Aβ40与Aβ42的水（pg/mgprotein。结果如表5所示。[0197]5APP/PS1Aβ1-40Aβ1-42水平极大地超过正常C57小鼠脑NTR1低、高剂量处理后，APP/PS1小鼠皮层和海马中两种长度的Aβ均呈梯度高剂量组的降低幅度超过了一倍。另外NTR1不影响Aβ42/Aβ40的比例。[0199]5R1N2a-APP695swPPARγ[0200]取购自师范大学教育部天然药物工程中心的N2a-APP695sw细胞，使用含有5%克隆胎牛，500ug/LG4181%GlutaMADMEM（H）OPTI-MEM等体积混合的培养基，在37℃恒温，5CO2902～3WesternBlot（0V0n10Vin （1:500p- （1:500p-NTR110μM100μMp-ERK蛋白水平。[0215]5N2a-APP695sw5×104的密度种于12孔板每孔1mL。37℃培养48h。换成不同浓度的NTR1（终浓度分别为01、buffer进行刮样品0.5mLEP100℃金属5min单离心20℃备用。[0216]参照实施例5中所述的WesternBlotIDE（1:500β-（1:2000W0IRDye800C（1:10000。对不同浓度NTR1处理后的N2a-APP695sw细胞中IDE水平进行分析。结果如图11所示。[0217]结果表明，经0-100μM的NTR1处理8h后，N2aAPP695sw细胞的IDE蛋白随NTR1浓度梯度10μM浓度下已与未处理具有显著性100μM的NTR1使其IDE蛋白水平升高了约40%。 375%CO290 NTR1（1μM10μM100μMAEBSF4℃12000rpm4℃12000rpm HμManAβ40ELISAKit和HμManAβ42ELISAKitN2a-APP695sw胞的Aβ水平。具体操作如下： DiluentBuffer 07.8115.6231.2562.5125250500pg/mL 015.6231.2562.51252505001000pg/mL 2上样及加一抗在ELISA孔板中每孔加入50μL标准品或样品稀释液以及50μLAβ1-40或Aβ1-42检测一（A