癌基因与抑癌基因研究进展课件

癌基因与抑癌基因研究进展最新统计资料显示，中国每年癌症新发病例为220万人，因癌症死亡人数为160万人。近20年来，中国每4-5个死亡者中就有一个死于癌症，居死亡原因之首。第一节肿瘤的发生机制一、肿瘤细胞的基本生物学特征（一）肿瘤细胞增殖失控（二）肿瘤细胞分化障碍（三）肿瘤细胞凋亡受阻（一）病毒癌基因virusoncogene（v-onc）

1968年Duesberg等首次发现Rous肉瘤病毒基因组编码酪氨酸蛋白激酶基因，证实它在细胞转化中起关键作用，来自病毒，因而被命名为病毒癌基因1、RNA肿瘤病毒（逆转录病毒）

（1）RNA肿瘤病毒的分类根据感染宿主后肿瘤发生快慢分类：1、急性转化病毒RouseSarcomaVirus（Rouse肉瘤病毒）潜伏期短（数周）、可以使培养的细胞癌变。2、慢性转化病毒AvianLeukosisVirus（禽白血病病毒

）潜伏期长、不能使培养细胞发生癌变。RNA肿瘤病毒是通过激活细胞的原癌基因来起作用的。（2）机制LTRgagpolenvLTRVirusDNAVirusproteinLTRgagLTRV-oncTransformingVirusDNAVirusprotein②逆转录病毒和携带细胞基因序列病毒基因组比较2、DNA肿瘤病毒如SV40、HPV、EB、乙肝病毒等其引起细胞恶性转化的机理可能在于：①存在于细胞中部分整合的或整个的DNA病毒引起细胞的癌基因功能紊乱②DNA病毒表达癌基因样蛋白产物③DNA病毒蛋白产物与某些细胞癌基因蛋白产物之间相互作用。

（二）细胞癌基因（又称原癌基因）原癌基因（oncogene）是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的，在进化上高度保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。一些原癌基因的功能原癌基因功能相关肿瘤sis生长因子Erwing网瘤erb-B受体酪氨酸激酶，EGF受体星形细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、唾腺癌fms受体酪氨酸激酶，CSF-1受体髓性白血病rasG-蛋白肺癌、结肠癌、膀胱癌、直肠癌src非受体酪氨酸激酶鲁斯氏肉瘤Abl-1非受体酪氨酸激酶慢性髓性白血病rafMAPKKK，丝氨酸/苏氨酸激酶腮腺肿瘤vav信号转导连接蛋白白血病myc转录因子Burkitt淋巴瘤、肺癌、早幼粒白血病myb转录因子结肠癌fos转录因子骨肉瘤jun转录因子

erb-A转录因子急性非淋巴细胞白血病bcl-1cyclinD1B细胞淋巴瘤（四）原癌基因的活化机制1.基因重排2.基因扩增3.点突变4.其它调控的异常1、基因重排(1)插入具有高活性的启动子或增强子，使原癌基因持久、过量地表达(2)负调控区的失活或丢失

染色体易位是原癌基因DNA重排的典型例子

人B淋巴瘤中免疫球蛋白基因与c-myc的重排，使c-myc激活:c-myc基因定位于8q24，Ig、Ig、Igλ链的基因位点分别定位在14q32、2p13和22q11c-myc易位到Ig位点的高活性转录区，从而组成一个高转活性的重排基因，启动c-myc转录，使c-myc表达增强，促进细胞恶变，最后导致肿瘤的发生(2)负调控区的失活或丢失小鼠c-myc，c-fos，c-mos等原癌基因在旁侧顺序具有抑制转录启动的负调控区人c-myc的负调控区在5’端428-1188bp处，而在B淋巴瘤中，该区有多点突变或部分丢失虽然这一结论还有待更多实验证实；但是，原癌基因上游或下游旁侧顺序存在负调控区（并不是个别现象），因而使原癌基因被激活的可能性大为减少3、基因扩增

基因扩增，可导致基因过量表达基因扩增一般被认为与恶性演进有关，未必是恶性早期的改变在人体肿瘤中，如：人肝癌中出现N-ras重排及其基因扩增小细胞肺癌中c-myc及L-myc基因扩增与癌转移可能有关神经母细胞瘤中N-myc基因扩增明显与病程发展有关4、其它调控的异常

反式（Trans）调控系统转录后的调控异常反式（Trans）调控系统已证明某些基因产物可影响其它基因的转录，如：病毒HTLV-Ⅰ，Ⅱ中TAT（LOR）区SV40中的某些片段RSV的gag区原癌基因很可能会接受其它基因（包括病毒的基因产物）的控制或影响如：v-myc进入细胞后，可关闭细胞本身c-myc的表达，同时，c-myc激活后亦可使另一个正常表达的c-myc等位基因关闭，提示：myc产物或由myc诱导产生的物质对c-myc的转录发生Trans的负控制ras癌基因家族1982年活化的H-ras基因在人膀胱癌细胞系中首先被发现，ras基因在人类肿瘤发生发展中所起的作用引起了极大关注。ras基因家族中与人类肿瘤相关的特征性基因有：

H-ras定位于11号染色体

K-ras定位于12号染色体N-ras定位于1号染色体

作用：参与细胞生长和分化的调控；参与多种肿瘤的形成与发展举例（一）ras家族的基因所共有的特征为：1.基因组中有5个外显子：4个编码的外显子和1个5’端非编码外显子

2.3类ras基因被翻译成4种Ras蛋白：H-Ras、N-Ras、K-RasA和K-RasB。除K-RasB(含189个氨基酸)外，其他Ras蛋白均含有188个氨基酸；分子量为21kD（p21蛋白）。这些蛋白具有高度特异性和同源性，尤其在氨基酸序列的前80个氨基酸残基中，几乎无种属间差别，具有高度保守性。（二）ras基因异常与细胞恶性转化正常情况下Ras信号链只有短暂的活性：GTP酶激活蛋白(GAP)激活GTP酶，及时降解与p21结合的GTP；p21Ras自身也有低度GTP酶活性，能够降解与其结合的GTP；→从而Ras蛋白转变成与GDP结合的非活性状态。ras蛋白信号通路出现异常导致细胞恶性转化(1)ras基因突变---最显著大约30％的人类肿瘤中出现ras基因点突变，最常见是K-ras的点突变(大约占85％)，其次是N-ras(约15％)，再次是H-ras(小于1％)。点突变的ras蛋白失去GTP酶活性，阻止GTP酶激活蛋白对ras蛋白活性形式的水解，从而导致ras蛋白以活性结合形式存在。在人类肿瘤中，几乎所有的ras蛋白活化是由编码子12、13和61的突变所致。(2)ras蛋白过表达常见于乳腺癌、膀胱癌、基底细细胞癌、鳞状细胞癌、皮脂腺癌、B细胞淋巴瘤，在乳腺癌、膀胱癌、鳞状细胞癌前驱病变中也发现ras蛋白过表达。(3)GTP酶激活蛋白缺失在肿瘤内ras蛋白也可能由于GTP酶激活蛋白的缺失而活化。最典型的例子就是由NF1基因编码的神经纤维素的缺失，NF1基因具有肿瘤抑制因子的所有特点。I型神经纤维瘤病的患者伴有NF1基因的一个等位基因的缺失，而NF1基因的2个等位基因缺失引起ras蛋白的持续活化从而导致恶性肿瘤的发生。(4)生长因子受体的活化ras蛋白信号通路经常由于生长因子受体酪氨酸激酶的过表达而活化。最常见的例子是EGFR和ERBB2，在许多人类肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌和胃癌中ras信号通路由于EGFR和ERBB2的过表达而活化。(5)ras下游效应子的突变或扩增在人类肿瘤特别是黑色素瘤(约70％)和结肠癌(约15％)中BRAF经常由于突变而活化；在少部分卵巢肿瘤中磷酸肌醇3激酶通路由于P110α基因的扩增而活化，同时在卵巢癌和乳腺癌中，磷酸肌醇3激酶通路由于PDK的下游靶标AKT2的扩增而活化；而且在肿瘤组织中，磷酸肌醇3激酶通路的直接激活是由肿瘤抑制基因PTEN的缺失所致。（三）ras基因与人类肿瘤

在所有人类肿瘤细胞的基因突变中，ras突变约占10％。其突变频率因肿瘤细胞类型而异：胰腺癌为75％-90％、结肠癌为40％-50％、肺癌为30％、急性白血病约为25％。然而在甲状腺肿瘤、皮肤癌、膀胱癌、子宫癌以及肝癌中却较少有ras的突变。突变ras基因的种类与某些肿病类型密切相关，即有优势激活现象。如胰腺癌、结肠癌、肺癌等以K-ras突变为主，造血系统肿瘤多发现N-ras的突变，泌尿系肿瘤则以H-ras突变为主。检测ras突变对了解肿瘤的发生发展，以及监测恶性肿瘤的治疗效果具有重大意义。三、抑癌基因（抗癌基因）最早由A.KnudsonJr.提出细胞内一类抑制肿瘤发生、生长的基因，最近又发展为指能对抗癌基因作用的基因。在生物体内与癌基因功能相抵抗，共同保持生物体内正负信号相互作用的相对稳定。肿瘤抑制基因的失活和癌基因的激活都是癌化过程的一部分。①转录调节因子：如Rb、p53②负调控转录因子：如WT③周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）：如p15、p16、p21④信号通路的抑制因子：如rasGTP酶活化蛋白（NF-1）、磷脂酶（PTEN）⑤DNA修复因子：如BRCA1、BRCA2⑥与发育和干细胞增殖相关的信号途径组分：如APC、Axin抑癌基因分类一些抑癌基因的功能抑癌基因功能相关肿瘤Rb转录调节因子RB、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、结肠癌p53转录调节因子星状细胞瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷状细胞肺癌WT负调控转录因子WT、横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤NF-1GAP，rasGTP酶激活因子神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪旺氏细胞瘤、神经纤维瘤DCC细胞粘附分子直肠癌、胃癌p21CDK抑制因子前列腺癌p15CDK4、CDK6抑制因子成胶质细胞瘤BRCA1DNA修复因子，与RAD51作用乳腺癌、卵巢癌BRCA2DNA修复因子，与RAD51作用乳腺癌、胰腺癌PTEN磷酯酶成胶质细胞瘤APCWNT信号转导组分结肠腺瘤性息肉，结/直肠癌

确定抑癌基因在理论上需要满足的三个基本条件1、在恶性肿瘤相应的正常组织该基因必须正常表达。2、在恶性肿瘤中，该基因有功能失活或结构改变或表达缺陷。3、将这种基因的野生型导入基因异常的肿瘤细胞中，可部分或完全改变其恶性表现。

1、Rb基因（视网膜母细胞瘤基因）

Rb（retinoblastomagene）是第一个被克隆的抑癌基因。

1986年，美国的三个实验室分别独立的克隆了该基因。

Rb基因，全长约200kb，含27个外显子，26个内含子，外显子大小不同短的31bp，长的有19kb，转录的mRNA有4.7kb,编码928个氨基酸，分子量是105-110kD的核内磷酸化蛋白。

Rb具有DNA结合活性，表明其能够参与某些基因的调节。（一）几种重要的抑癌基因

Rb基因的磷酸化状态是Rb基因调节细胞生长分化的主要形式。调节Rb功能最主要的磷酸化事件在G1和S期交界处。磷酸化的Rb与细胞内蛋白结合形成复合物的能力丧失。

如，Rb在非磷酸化状态下可以与E2F结合，并抑制其活化基因表达的功能。磷酸化的Rb不能与E2F结合。E2F与DP1蛋白形成异二聚体活化一系列由G1期进入S期所必需的基因的表达。（1）Rb基因的生物学活性G2G1SMCellcycleDPE2FDNAsynthesis-relatedgenesE2FRbPE2FCyclinD1CDK4RbPPPPPRbPPPPPE2FE2FE2FE2FDPE2FDNAsynthesis-relatedgenes（二）Rb基因异常与肿瘤

Rb基因异常主要表现为等位基因缺失和基因突变。最初，在视网膜母细胞瘤中发现，后来在多种肿瘤中均发现该基因的异常。其基因异常多发生在13-17外显子上。在小细胞肺癌中异常为50%，骨肉瘤47%，乳腺癌32%.

二次突变假说1971年，Knudson在研究视网膜母细胞瘤时提出了“二次突变”假说。假说认为，在有遗传倾向的的病人体内所有干细胞和体细胞都存在一种突变，在此基础上，任一视网膜母细胞若再出现第二次突变，即可导致肿瘤发生。（a）散发性Rb发生较晚，一般只危及一眼；（b）遗传性Rb往往危及双眼，3岁左右发病形成多个肿瘤2、p53基因1979年，发现SV40转化的细胞中p53与SV40-largeT抗原结合，而被误认为癌基因，直到1989年，才被证实为抑癌基因P53基因于1979年被发现；1993年被Science杂志评为明星分子。截至2010.11.16，PubMed上以p53作为关键词检索到的文献已经多达55713篇.临床上，超过50%的肿瘤其p53有异常。NC100-300AADNA结合域调节domain301-3931-99p53protein

p53基因全长20kb，定位于人类染色体17p13.1，由11个外显子组成，编码393个氨基酸组成的53kd的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合的功能。（1）p53基因的结构（2）p53基因生物学特性p53蛋白是细胞生长周期中的负调节因子，在G1/S期起作用，在细胞周期调控、DNA修复和诱导细胞凋亡等方面均具有关键性作用。p53BaxP21（细胞周期素依赖激酶抑制剂-1A）Cellcyclearrest细胞周期停滞ApoptosisMDM2（小鼠双微体扩增基因2）

P14arf(p14可变阅读框基因)Manyfactors(主要是造成基因组完整性的损伤)GADD45（生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45）Morethan100proteins+++--+（3）p53基因分型p53基因分为野生型和突变型，它的表达产物也分为野生型和突变型野生型p53极不稳定，半衰期仅为数分钟，并具有反式激活功能和光谱的抑制肿瘤的功能。突变型p53具有癌基因的功能，促进癌细胞的恶性转化。（4）p53基因异常与肿瘤

p53基因缺失或突变已被证实是绝大多数肿瘤发生的原因之一

肿瘤中p53的突变形式：点突变、缺失突变、插入突变、移码突变、基因重排。

绝大多数突变集中在第5-8外显子处，即“热点突变”(以175、248、249、273、282位点突变最高，不同种类肿瘤不同）。少数突变存在于其它外显子或内含子的剪切位点上。p53大多数点突变是引起蛋白功能改变的错义突变，少数是无义突变或终止码突变。3、NF1基因(多发性神经纤维瘤基因1型)4、WT1基因（肾母细胞瘤基因1型）四、癌基因与抑癌基因协同致癌作用由于恶性变是多步骤的过程，恶性肿瘤形成以后癌细胞经过不断的突变和选择，其恶性行为逐步升级即演进（progression）（包括侵润、转移及治疗过程中发生的抗放射性、抗药性），理应涉及许多基因的的激活并参与作用，但目前仅变恶性变而言，需要多少个肿瘤基因参与，还不够清楚。至于恶性肿瘤形成以后，哪些基因产物与恶性肿瘤的演进过程有关更是基本上空白的领域。

单个肿瘤基因的致癌作用，仅仅在动物体建株细胞中得到证明，以具有突变的ras基因为例，仅在小鼠NIH3T3，大鼠RAT-1，中国仓鼠（CHEF）等成纤维细胞中能致使恶变，最近有报道用小鼠乳腺上皮细胞株同样可作为受体细胞。必须指出：过去不少人指责NIH3T3是已经超越恶性变最早期阶段、染色体核型不正常的细胞，因而用于分离肿瘤基因不可靠。实际上，这种看法还不全面，应该说所有上述列举的细胞，均属建株的细胞，已具有永生化（immoutalization）的特征，演化到恶性变的第一个台阶，因此用它的作为受体细胞，可以说明某些原瘤基因已被激活，但是并不等于人体肿瘤中激活肿瘤基因仅限于这几种。根本的原因是，除上述细胞均非“正常”细胞以外，DNA转染技术本身也有很大局限性。(一)单个肿瘤基因的作用

两类肿瘤基因的协同作用，仅在啮齿类原代培养细胞系统得到了证明。在原代培养成纤维细胞（大鼠、金仓鼠）中，细胞恶变需要两大类肿瘤基因参与作用，一类是促使细胞永生化，包括c-myc，N-myc，p53AdEla、EBV的EBVA-2，SV40T等；第二类是促使细胞形态学出现恶变特征，及软琼脂中生长等，包括Ha-ras，Ki-ras，AdElb，PomT（多瘤病毒中T基因）等。上述肿瘤基因包括某些细胞本身的肿瘤基因和外源性病毒的某些片段。只有两类肿瘤基因协同作用，才能使细胞完全恶变，不仅在体外显示恶性特征，而且能在裸鼠体内形成肿瘤。(二)两类肿瘤基因的协同作用(三)人体细胞系统肿瘤基因的作用在人体细胞中，上述两类肿瘤基因的协同作用，仍不足以引起细胞恶变。例如，突变的ras基因和myc基因并不能使人成纤维细胞或造血细胞恶变，这提示，应考虑到几种可能性：1.可能尚需其他肿瘤基因的参与使人体细胞恶变，除上述两类肿瘤基因，还需要其它肿瘤基因的参与，包括生长因子或受体基因的改变等。2.可能尚需抗癌基因的失活或丢失，要使人体细胞恶变，激发的肿瘤基因需要在另一类基因（抗癌基因）发生失活或丢失的条件下才能发挥作用。3.可能尚需细胞内基因组遗传稳定性受破坏，要使激活的肿瘤基因在人体细胞恶变中发挥作用，需要一个前提，即细胞内基因组的遗传稳定性受到破坏，这种情况可能由化学致癌物或病毒所引起。

对癌基因与抗癌基因的评论如果说癌基因是一个涵义混乱不确切的命名，抗癌基因是同样的模糊不清所谓癌基因与抗癌基因都是一大类控制细胞生长和分化的基因，对其单个基因来说，它的产物所具有的功能因细胞种类甚至细胞发育阶段而异1．癌基因与抗癌基因的相对意义:

同一种癌基因及其产物，在不同细胞中可起完全

相反的作用最典型的例子是ras基因及其产物p21。在成纤维细胞中已有充分证据说明，微量注入p21蛋白能使细胞迅速进入S期和开始分裂。人ras基因可使成纤维细胞和某些上皮细胞恶变。但对点突变的嗜铬细胞瘤pc12细胞，将ras基因引入或微量注射p21使恶性细胞停止分裂并开始分化。src基因对鸡成纤维细胞中的致癌作用是确定无疑的，但在胚胎发育过程中，src基因的表达神经系统的分化密切相关，估计这样的例子可能不尽是个别的从生物学意义上来说，ras基因对成纤维细胞来说是癌基因，对交感神经切来源的pc12来说是抗癌基因。同一基因的产物，是促进生长或抑制生长，是抗癌还是致癌，似乎不取决于该基因的本身，而决定于细胞类别的差异。同时提示不同细胞中以ras基因产物的效应系统不同，因此最后的生物学功能也不同。2.促进和抑制