基因操作原理05课件

第五章PCR技术原理PCR，polymerasechainreaction是80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。一、PCRprinciple1．基本要素PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性地扩增DNA某个特殊区域的技术·template：ssDNAordsDNA·primers：oligo-nucleotides等·substrates:dNTP·DNApolymerase:TaqpolyDNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'templateprimerDNApolymeraseDNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'DNAamplificationdATPdGTPdCTPdTTPMg2+buffer5'3'3'5'

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引物设计原理①长度至少16bp,通常20-30bp②Tm=81.5+16.61og[J+]+0.41(G+C)%-(675/N)N:链长J：单价离子浓度若N=20G+C%=55%[J+]=60mmol/L则Tm=81.5-20.3+22.6-33.75=50.05简单计算Tm=(G+C)×4+(A+T)×2对于较短引物Operon公司③避免二级结构的形成二聚体二级结构④G/C和A/T分布尽量均匀,一般G+C%45-55%oligodT/oligodC除外，

⑤其它，如5’末端，限制酶位点的长度⑥随机引物6nt10-12nt4.模板templategorng1021051g人类单拷贝基因组DNA3×105targets10ngyeastDNA3×1051ngE.coliDNA3×1051ng1kbDNA9×1061%M13plaque1065.聚合酶DNApolymerase

1-2U早期使用klenow(1)TaqDNApolymerase,75℃,94kDaThermusaquticus嗜热水生菌，水生栖热菌具有5’--3’合成和5’3’外切,无35’外切Taqhalf-time>2hr92.5℃40min95℃5min97.5℃相似酶,Tflpolymerase,82kDa

Thermusflavus使用MgSO4·sequencinggrade74℃低5’3’外切活性80kDa(2)TthDNApolymeraseThermusthermophilusHB8,94kDa,Mg2+:5’3’合成DNAMn2+:以RNA为模板合成cDNA可解决RNA反转录过程中形成的二级结构·反转录:primerextension,cDNA合成(3)具3’--5’外切活性的高温DNApolymeraseA.VentDNApoly(NewEnglandBlabs)

Thermococcuslitoralis,85kDaHalf-life:1.8hrat100℃(使用MgSO4)而Taq5minB.TliDNApoly(Promega)85kDa来源同VentC．PwoPyrococcuswoesei(BMRoche)90kDaHalf-life>2hrat100℃<5minforTaqD.PfuPyrococcusfuriosus激烈热球菌（stratagene）E.商用混合酶pfuIdealforhigh-fidelityamplificationLowesterrorrateofanythermostableDNApolymerasestudiedOneofthemostthermostableDNApolymerasesknownLackofextendaseactivitymeansnounwanted3’overhangsOptimalforblunt-endPCRcloningOptimumtemperaturenear75°C95%activeafter1-hourincubationat98°CNativeandrecombinantversionsavailable三、PCR反应程序1.常用程序94-96℃预加热10’’-几分钟/加酶94℃30”55℃30”72℃1’72℃3-7min4℃2．复性（退火温度）Tm-5℃特异性高，需高温若高Tm，则采用2步法55℃-72℃有时用37℃(随机引物)3．时间变性30”若G+C高可长，若为Cell可长复性30”(20”-40”)延伸1min>>1kb55℃24nt/秒37℃1.5nt/秒72℃500bp20’’,1.2kb40’’存在二级结构也应延长时间特殊:10循环后，每次延伸增加，10”,30”,or1’4．循环次数25～35tergest(起始模板)所须循环数3×10525～30(1ug哺乳动物DNA)1.5×10430～351×10335～405040～45Nf=N0(1+Y)nN0起始拷贝数，Nf最终拷贝数，Y延伸效率，n循环数ifNf=1012,

Y=70%,N0=3×105,thenn=28.6平台效应plateaueffect在PCR反应后期,产物的积累按减弱的指数速率增长(一般已积累到0.3～1pmol产物)原因:底物浓度降低，dNTPorPrimersdNTPorenzyme的稳定性末端产物抑制(pyrophosphate焦磷酸,dsDNA)非特异性竞争(非特异性产物orprimer-dimer)特异性产自身复性(>10-8M)高浓度产物下,变性不彻底.避免出现背景5．反应液的配制(1)常规最后加酶,及矿物油(2)具3’-5’活性酶A:template,primer,dNTPH2OB:bufenzymeH2O(3)热起始下层:dNTPbufprimer中间:蜡珠(AmpliWaxPCRQam100)上层:template(Taq)·先加下层液,再一粒蜡株,70℃10min5℃5min·迅速加30l上层混合物PerkinElmer4800MJResearch四、PCR介导的克隆(一)添加限制性酶切位点1.引物的设计(引入酶切位点）

切点的类型优先8base序列,如AscINotIPacI,PmeI,SfiI,SrfI若内部序列为已知,则可根据需要进行设计

切点的位置参见限制性内切酶部分如EcoRI,5’端有一个C，在2hr内可切割90%HindIII5’端有3个C在2hr内可切割10%20hr内可切割75%2．综合处理(当酶切位点在最末端时)Kinase处理，在5’端加一个磷酸Klenow补平Ligase连接成多聚体酶切，回收目标DNA片段3.NestPCR1st2nd（二）A/T克隆法1.PCR产物：Taqpoly产物的3’末端一般要在3’末端加一个核苷酸,通常为A2.载体pGEM-T,pGEM-TEasy(promega)pCR-3,pCR-II,pCR-3-Uni(半磷酸化)(Invitrogen)核心线性DNA·末端转移酶加ddTMP·产生单个T的限制性内切酶如MboII,XcmI,HphI,HphI,GGTGA(8/7)MobII,GAAGA(8/7)·TaqDNApoly+高浓度dTTP（三）平端克隆法用于克隆具3’→5’外切活性的DNApoly扩增的PCR产物·pCRScript(stratagene)类似pBluescriptMSC:NofISrfI,BamHI,SmaI,PstI,EcoRI,EcoRVH3SrfI:GCCC↓GGGCSmaI,CCC↓GGGC·pCRScriptSrfI（四）不需要连接反应的克隆方法1．UDG克隆法UDG酶是参与TTP生物合成的一种酶，水解脱氧核糖与尿嘧啶之间的N-糖苷键,产生脱碱基的dU,从而破坏DNA的碱基配对Uracil-DNAGlycosylase2．外切法（五）反向PCR(inversePCR)“正向”“反向”（六）长片段的PCR克隆许多公司开发出一些用于扩增长片段的反应体系多用混合酶(如Pwo,Pfu)来扩增TaqPwoLongsys0.9kb1.1kb2.94.86.3科学出版社C.W.迪芬巴赫/G.S德维克斯勒，1998C．W．Dieflenbach/G.S.Dueksler五、PCR介导的诱变(一)PCR随机突变每循环Taq错配率在0.1～2×10-4之间。20-25cycles后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3,但对于构建一个具有不同序列的变异库仍然不够，特别是<1kb的片段。原因：在普通条件下，具较大定向错配即AT对变GC对。设计出一种致突变PCR法，使错误率达7×10-3，且无倾向性。①Mg2+→7mM②Mn2+→0.5mM③提高dCTT/dTTT到1M，促进错误掺入④提高Taq酶量，促进延伸链在碱基错配位置继续延伸DNAshuffling,DNA改组,无引物PCRDNaseI处理DNA片段，分子进化(二)PCR定点诱变1．同源重组法在一般宿主内发生同源重组,但需高转化效率1x109/ug2．DpnI法DpnI只切割甲基化的DNA,在PCR扩增后，可切除模板DNA从而使得用突变引物扩增出来DNA保存下来GeneinplasmidwithmutationtargetsiteDenatureplasmidandannealingprimerscontainingdesiredmutationMutagenicprimersTemperaturecycletoextendandincorporatemutationprimersresultinginnickedcirclarstrandstransformDigestparentalDNAtemplateAftertransformation,XL1-BlueE.colicellrepairsnicksinplasmidTransformtheresultingannealeddouble-strandednickedDNAmoleculesMutated