微生物遗传变异物质基础

微生物遗传变异物质基础第一页，共八十三页，2022年，8月28日遗传：亲代与子代相似变异：亲代与子代、子代间不同个体不完全相同遗传(inheritance)和变异(variation)是生命的最本质特性之一。遗传型：表型：生物的全部遗传因子所携带的遗传信息具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的外表特征和内在特征的总和。表型是由遗传型所决定，但也和环境有关。第二页，共八十三页，2022年，8月28日表型饰变：表型的差异只与环境有关特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为遗传型变异（基因变异、基因突变）：遗传物质改变，导致表型改变特点：遗传性、群体中极少数个体的行为Productionofaredpigment(prodigiosin)bySerratiamarcescens.

Fromlefttoright:slantculturegrownat25°C,slantculturegrownat37°C,brothculturegrownat25°C,brothculturegrownat37°C.

第三页，共八十三页，2022年，8月28日微生物是遗传学研究中的明星：微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系；很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖；物种和代谢类型多样；对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。第四页，共八十三页，2022年，8月28日第一节遗传变异的物质基础一、三个证明核酸是遗传物质的经典实验1、经典转化实验肺炎链球菌：S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）

R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）第五页，共八十三页，2022年，8月28日1928年，F.Griffth作了3组实验:第六页，共八十三页，2022年，8月28日1944年，Avery精确重复了转化实验，确定了转化因子实验证明，将R菌转化为S菌的转化因子是DNA第七页，共八十三页，2022年，8月28日2、T2噬菌体感染实验1952年Hershey和Chase用32P标记DNA，用35S标记蛋白。实验证明，进入细菌细胞内部的物质是DNA。DNA包含有产生完整噬菌体的全部信息。第八页，共八十三页，2022年，8月28日3、植物病毒重建实验1956年H.Fraenkel-Conrat用烟草花叶病毒进行拆分与重建实验证明，RNA也是遗传物质基础。第九页，共八十三页，2022年，8月28日二、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式（一）遗传物质在7个水平上的形式1、细胞水平2、细胞核水平3、染色体水平4、核酸水平5、基因水平6、密码子水平7、核苷酸水平第十页，共八十三页，2022年，8月28日1、细胞水平真核微生物：细胞核原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的第十一页，共八十三页，2022年，8月28日2、细胞核水平真核生物细胞核核染色体原核生物核区DNA链核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质第十二页，共八十三页，2022年，8月28日3、染色体水平（1）染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构；（2）染色体的数目在不同的生物中是不同的；（3）染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的；第十三页，共八十三页，2022年，8月28日4、核酸水平核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。第十四页，共八十三页，2022年，8月28日5、基因水平第十五页，共八十三页，2022年，8月28日6、密码子水平第十六页，共八十三页，2022年，8月28日7、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位第十七页，共八十三页，2022年，8月28日第二节微生物基因组结构的特点1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组1）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续性；3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；第十八页，共八十三页，2022年，8月28日2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1996年由96个实验室633位科学家完成测序工作。1）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。2）没有明显的操纵子结构；3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；4）重复序列多，遗传丰余；第十九页，共八十三页，2022年，8月28日3、詹氏甲烷球菌的基因组该古生菌发现于1982年，生活在2600米深、260个大气压、94℃海底火山口。1996由美国基因研究所等完成测序。1）有近一半的基因在基因数据库中找不到同源序列；2）基因组在结构上类似于细菌；3）负责信息传递功能的基因（复制、转录、翻译）类似于真核生物；4）是真细菌和真核生物特征的一种奇异的结合体。第二十页，共八十三页，2022年，8月28日4、原核生物和真核生物的基因组比较第二十一页，共八十三页，2022年，8月28日第三节原核生物的质粒与转座因子

一、质粒

一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。第二十二页，共八十三页，2022年，8月28日大小：约为2-100×106Dalton，上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。1、性质①可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在（游离态），也可以通过交换掺入染色体上，以附加体（episome）的形式存在；②质粒是一种复制子（replicon），根据自我复制能力的不同，可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种，严紧型质粒的复制受细胞核控制，与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个（1-5）个拷贝；松弛型质粒的复制不受细胞核控制，在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制，在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。③可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中，可成为基因工程的载体。④对于细菌的生存并不是必要的⑤功能多样化第二十三页，共八十三页，2022年，8月28日2、结构特点通常以共价闭合环状(covalentlyclosedcircle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有OC型、L型双链DNA质粒和RNA质粒；质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；

细菌质粒多在10kb以内第二十四页，共八十三页，2022年，8月28日3、质粒的类型严谨型质粒(stringentplasmid)：复制行为与核染色体的复制同步，低拷贝数松弛型质粒(relaxedplasmid)：复制行为与核染色体的复制不同步，高拷贝数窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）第二十五页，共八十三页，2022年，8月28日4、质粒在基因工程中的应用质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定（3）独立复制（4）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选E.coli的pBR322质粒是一个常用的克隆载体第二十六页，共八十三页，2022年，8月28日5、质粒的检测提取所有胞内DNA后电镜观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。第二十七页，共八十三页，2022年，8月28日6、质粒的主要种类质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性因子（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）第二十八页，共八十三页，2022年，8月28日（1）致育因子(Fertilityfactor，F因子)又称F质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。携带F质粒的菌株称为F+菌株（相当于雄性），无F质粒的菌株称为F-菌株（相当于雌性）。F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。第二十九页，共八十三页，2022年，8月28日（2）抗性因子（Resistancefactor，R因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R质粒抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因抗性决定因子：抗性基因第三十页，共八十三页，2022年，8月28日R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（mercuricion，mer）四环素（tetracycline，tet）链霉素(Streptomycin,Str)、磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素(Chlorampenicol,Cm)、夫西地酸（fusidicacid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。第三十一页，共八十三页，2022年，8月28日（3）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）第三十二页，共八十三页，2022年，8月28日一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因。第三十三页，共八十三页，2022年，8月28日（4）毒性质粒（virulenceplasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。第三十四页，共八十三页，2022年，8月28日产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒。根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子。第三十五页，共八十三页，2022年，8月28日第三十六页，共八十三页，2022年，8月28日Ti质粒中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体。第三十七页，共八十三页，2022年，8月28日（5）代谢质粒（Metabolicplasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。第三十八页，共八十三页，2022年，8月28日假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯)、农药(2,4dichlorophenoxyaceticacid)、辛烷和樟脑等的能力。第三十九页，共八十三页，2022年，8月28日（6）隐秘质粒（crypticplasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体（一般加上抗性基因）。第四十页，共八十三页，2022年，8月28日二、转座因子转座因子：是在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA序列。也称作跳跃基因（jumpinggene）或可移动基因（movablegene）。广泛存在于原核和真核细胞中。首先在于米中发现。类型：

插入顺序IS：最简单的转座因子，分子量最小,大小在250-1600bp，只能引起转座效应而不含其它基因,即只含有转座酶基因。

转座子Tn：它含有几个至十几个基因，其中除了与转座作用有关的基因外，还含有抗药基因或乳糖发酵基因等其它基因。特殊病毒：Mu噬菌体，大肠杆菌温和噬菌体。Mu噬菌体的分子量最大（37kb），它含有20多个基因。第四十一页，共八十三页，2022年，8月28日第四十二页，共八十三页，2022年，8月28日第四十三页，共八十三页，2022年，8月28日（1）引起插入突变（2）引起染色体畸变（3）基因的移动和重排转座引起的遗传学效应第四十四页，共八十三页，2022年，8月28日第四十五页，共八十三页，2022年，8月28日第四节基因突变及修复基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变可遗传、自发或诱变产生.突变狭义：点突变（基因突变）广义：基因突变和染色体畸变野生型（原始性状）基因突变突变型（新性状）一、基因突变类型

his-his+Strrstrs温度敏感突变

ts第四十六页，共八十三页，2022年，8月28日碱基变化与遗传信息的改变同义突变：由于生物地遗传密码子存在兼并现象,是碱基被替换之后,产生了新地密码子，但新旧密码子是同义密码子，所编码的氨基酸种类保持不变，因此同义突变并不产生突变效应。错义突变：是编码某种氨基酸地密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸地密码子,从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。错义突变的结果通常能使多肽链丧失原有功能，许多蛋白质的异常就是由错义突变引起的。第四十七页，共八十三页，2022年，8月28日无义突变：由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子，从而使肽链合成提前终止。移码突变：在正常地DNA分子中,碱基缺失或增加非3地倍数,造成这位置之后的一系列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。

例如原来的mRNA是GAA、GAA、GAA、GAA……按照密码子所合成的肽链是一个谷氨酸的多肽。如果开头增加一个G，那么mRNA就变成了GGA、AGA、AGA、AGA……按照这些密码子合成的肽链就是一个一甘氨酸开头的精氨酸的多肽。移码突变的结果将引起该段肽链的改变，而肽链的改变将引起蛋白质性质的改变，最终引起性状的变异。严重是会导致个体的死亡。第四十八页，共八十三页，2022年，8月28日★按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分：选择性突变株（selectivemutant）：具有选择标记（如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型），只要选择适当的环境条件，如培养基、温度、pH值等，就比较容易检出和分离到。非选择性突变株（non-selectivemutant）：无选择标记（如产量突变型、抗原突变型、形态突变型），能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。第四十九页，共八十三页，2022年，8月28日★依表型的改变分为：形态突变型——造成形态改变的突变型营养缺陷型——因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力，并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。抗性突变型——因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性条件致死突变型——突变后在某种条件下可正常生长繁殖，而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型抗原突变型——因突变而引起的抗原结构发生改变产量突变型第五十页，共八十三页，2022年，8月28日平板影印培养法：是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法。把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上的菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。通过影印培养法，就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中，分离出各种类型的突变株。第五十一页，共八十三页，2022年，8月28日第五十二页，共八十三页，2022年，8月28日第五十三页，共八十三页，2022年，8月28日不对应性：突变的性状与突变原因之间无直接对应关系。稀有性：突变率低且稳定，10-6

～

10-10

。规律性：指微生物某一特定性状的突变率有一定的规律性。独立性：各种突变独立发生，不会互相影响。遗传和回复性：突变是遗传物质结构的改变，可稳定遗传。从原始的野生型基因到变异株的突变称为正向突变，从突变株回到野生型的过程则称为回复突变。可诱变性：诱变剂可提高突变率。二、基因突变分子基础1、自发突变第五十四页，共八十三页，2022年，8月28日基因突变自发性和不对应性的实验证明三个经典实验变量实验涂布实验影印实验证明突变是自发产生的，并且突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系。野生型（原始性状）特定环境突变型（适应环境的新性状）驯化定向诱变筛选？？？突变的原因？第五十五页，共八十三页，2022年，8月28日自发突变分子基础：互变异构效应碱基T、G的第六位上是酮基，会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现C、A的第六位上是氨基，会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现在偶然情况下，在DNA复制到达这一位置的瞬间，在T以稀有的烯醇式出现时，其相对位置上就出现G同样，如果C以稀有的亚氨基形式出现在DNA复制到达这一位置的瞬间，则在新合成DNA单链中与C相对应的位置上就将是A。这可能就是发生相应的自发突变的原因。据统计，碱基对发生自发突变的几率约为10–8~10–9。第五十六页，共八十三页，2022年，8月28日碱基的置换：对DNA来说，碱基的置换属于一种染色体的微小损伤，一般也称点突变（pointmutation）。它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换。第五十七页，共八十三页，2022年，8月28日碱基的置换引起的突变第五十八页，共八十三页，2022年，8月28日2、诱发突变利用物理、化学和生物的方法，提高突变率的人为的作法。诱变剂（mutagen）：凡能提高突变率的任何理化因子，就称为诱变剂种类：诱变剂的种类很多，作用方式多样。即使是同一种诱变剂，也常有几种作用方式。第五十九页，共八十三页，2022年，8月28日（1）碱基类似物：如：5-溴尿嘧啶(5-BU)和5-氨基尿嘧啶（5-AU）、叠氮胸腺嘧啶（AIT）等等；

作用方式：通过活细胞的代谢活动参入到DNA分子中，主要是在DNA复制时碱基类似物插入DNA中，引起碱基对配对错误，造成碱基置换。

以5-溴尿嘧啶(5-BU)为例：

5-BU是胸腺嘧啶（T）的的类似物，酮式的5-BU可以和A配对，烯醇式的5-BU可以和G配对，在DNA分子复制的过程中，由于5-BU的插入和互变异构导致碱基置换。第六十页，共八十三页，2022年，8月28日第六十一页，共八十三页，2022年，8月28日5-BU引起的转换第六十二页，共八十三页，2022年，8月28日5-BU引起的转换通过这两个图示，就很容易理解为什么同一种诱变剂既可造成正向突变，又可使它产生回复突变的原因了。也可以知道，为什么像5-BU这类代谢类似物只有对正在进行新陈代谢和繁殖着的微生物才起作用，而对休止细胞、游离的噬菌体粒子或离体的DNA分子却不起作用。第六十三页，共八十三页，2022年，8月28日（2）移码突变（插入染料）：添加或缺失核苷酸，引起阅读错误错误+错误-+正常---正常+++正常第六十四页，共八十三页，2022年，8月28日（3）直接与DNA碱基起化学反应的诱变剂定义：一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或是在离体条件下均有作用。种类：例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯，甲基磺酸乙酯，N-甲基-N’硝基-N-亚硝基胍，N-甲基-N-亚硝基脲，乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等）。作用：它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，从而引起DNA复制时碱基配对的转换，并使微生物发生变异。羟胺只引起G┇C→A:T，其余都是可使G┇C=A:T发生互变的。能引起颠换的诱变剂很少，只是部分烷化剂才有。第六十五页，共八十三页，2022年，8月28日若干诱变剂的作用机制及诱变功能

诱变因素 在DNA上的初级效应 遗传效应碱基类似物 掺入作用 AT=GC双向转换羟胺 与胞嘧啶起反应 GC→AT的转换亚硝酸 A、G、C的氧化脱氨作用 AT=GC双向转换 交联 缺失 烷化剂 烷化碱基（主要是G） AT=GC双向转换 烷化磷酸基团 AT→TA的颠换 丧失烷化的嘌呤 GC→CG的颠换 糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形） 码组移动（＋或－） 紫外线 形成嘧啶的水合物 GC→AT转换 形成嘧啶的二聚体 码组移动（＋或－） 交联 电离辐射 碱基的羟基化核降解 AT=GC双向转换

DNA降解 码组移动（＋或－） 糖-磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位） 丧失嘌呤

加热 C脱氨基 CG→TA转换

Mu噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动 第六十六页，共八十三页，2022年，8月28日亚硝酸可以使碱基发生氧化脱氨作用。

HNO2胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）HNO2腺嘌呤（A）次黄嘌呤（H）HNO2鸟嘌呤（G）黄嘌呤（X）

碱基转换的分子机制——以亚硝酸为例第六十七页，共八十三页，2022年，8月28日（4）辐射和热：紫外线、x射线等（5）生物诱变因子：转座因子第六十八页，共八十三页，2022年，8月28日腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤（H）后引起的转换过程：①腺嘌呤氧化脱氨后形成烯醇式次黄嘌呤（He）②He通过互变异构效应形成酮式次黄嘌呤（HK）③DNA复制时，HK与胞嘧啶（C）配对④DNA第二次复制时，C与G正常配对，实现了转换。第六十九页，共八十三页，2022年，8月28日3、Ames试验“生物化学统一性”法则：人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。诱变剂的共性原则：化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用第七十页，共八十三页，2022年，8月28日美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变第七十一页，共八十三页，2022年，8月28日第七十二页，共八十三页，2022年，8月28日第七十三页，共八十三页，2022年，8月28日第七十四页，共八十三页，2022年，8月28日证明Ames试验重要性的应用实例：

国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行，但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用。第七十五页，共八十三页，2022年，8月28日嘧啶嘧啶二聚体UV嘧啶二聚体嘧啶光解酶第七十六页，共八十三页，2022年，8月28日定义：经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。这一现象最早是A.Kelner（1949）在Strepotomycesgriseus（灰色链霉菌）中发