微生物的菌种选育

微生物的菌种选育第一页，共一百零一页，2022年，8月28日5.2.2基因突变和诱变育种第二页，共一百零一页，2022年，8月28日基因突变诱变育种第三页，共一百零一页，2022年，8月28日一、基因突变（genemutation）一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变简称突变，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。突变几率一般很低（10-6～10-9）第四页，共一百零一页，2022年，8月28日从自然界分离到的菌株，简称野生型。

野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，又称突变体或突变型。突变株（mutant）野生型菌株（wildtypestrain）第五页，共一百零一页，2022年，8月28日（一）突变类型凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。选择性突变株（selectivemutant）非选择性突变株（non-selectivemutant）反之。第六页，共一百零一页，2022年，8月28日表型基因型这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化的突变型及其分离第七页，共一百零一页，2022年，8月28日link1突变株的表型非选择性突变株选择性突变株抗性突变型（株）营养缺陷型（株）条件致死突变型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）第八页，共一百零一页，2022年，8月28日突变率每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率例如，突变率为10-8的，指该细胞在1亿次细胞分裂中，会发生1次突变。某一单位群体在每一世代（即分裂1次）中产生突变株（mutant，即突变型）的数目来表示例如，一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是10-8。（二）突变率（mutationrate）第九页，共一百零一页，2022年，8月28日第十页，共一百零一页，2022年，8月28日突变一般是独立发生的。某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的。第十一页，共一百零一页，2022年，8月28日（三）基因突变的特点基因突变的7个共同点（1）自发性各种性状的突变，可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。第十二页，共一百零一页，2022年，8月28日（2）非对应性突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题（3）稀有性自发突变虽可随时发生，但其突变率却是极低和稳定的，一般在10-6～10-9间。第十三页，共一百零一页，2022年，8月28日某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。（5）可诱变性自发突变的频率可因诱变剂（mutagen）的影响而大为提高（10～105倍）。（4）独立性第十四页，共一百零一页，2022年，8月28日基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。野生型菌株某一性状可发生正向突变（forwardmutation），也可发生相反的回复突变（reversemutation或backmutation

，也称回变）。（7）可逆性（6）稳定性第十五页，共一百零一页，2022年，8月28日（四）基因突变自发性和不对应性

的实验证明如何证明基因突变的非对应性？第十六页，共一百零一页，2022年，8月28日证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！三个经典实验变量实验、涂布实验、影印实验第十七页，共一百零一页，2022年，8月28日1.变量试验（fluctuationtest）又称波动试验或彷徨试验。1943年，S.E.Luria和M.Delbrück根据统计学的原理，设计实验。SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969甲管乙管第十八页，共一百零一页，2022年，8月28日2.涂布试验（Newcombeexperiment）1949年，在《NATURE》上发表了一篇与变量试验属同一观点的但实验方法更为简单的涂布试验结果。第十九页，共一百零一页，2022年，8月28日3.平板影印培养试验（replicaplating）1952年，J.Lederberg夫妇发表了一篇著名的《平板影印培养法和细菌突变株的间接选择》论文，它更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应的药物环境毫不相干。第二十页，共一百零一页，2022年，8月28日影印的作用是保证这3个平板上所长出的菌落的亲缘和相对位置保持严格的对应性。第二十一页，共一百零一页，2022年，8月28日JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958第二十二页，共一百零一页，2022年，8月28日（五）基因突变及其机制仅影响一对碱基影响一段染色体第二十三页，共一百零一页，2022年，8月28日

诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。1.诱发突变（inducedmutation）凡具有诱变效应的任何因素，都称诱变剂（mutagen）。第二十四页，共一百零一页，2022年，8月28日(1)碱基的置换（substitution）碱基的置换只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的点突变（pointmutation）。染色体的微小损伤（microlesion）第二十五页，共一百零一页，2022年，8月28日碱基的置换转换（transition）颠换（transversion）一个嘌呤另一个嘌呤一个嘧啶另一个嘧啶一个嘌呤另一个嘌呤一个嘧啶另一个嘧啶第二十六页，共一百零一页，2022年，8月28日第二十七页，共一百零一页，2022年，8月28日(2)移码突变（frame-shiftmutation，phase-shiftmutation）指诱变剂使DNA序列中的一个或少数几个核苷酸发生增添（插入）或缺失，从而使其后面的全部遗传密码发生阅读框发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。第二十八页，共一百零一页，2022年，8月28日由吖啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示：（双线部分代表正常密码子，单线部分表示不正常）①正常DNA链上的三联密码子：②第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子：第二十九页，共一百零一页，2022年，8月28日③在第二个密码子上缺失一个碱基A后引起的变化：④增添一个碱基和缺失一个碱基后，其后的密码子又恢复正常：第三十页，共一百零一页，2022年，8月28日⑥如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：⑤增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常：第三十一页，共一百零一页，2022年，8月28日(3)染色体畸变（chromosomalaberration）电离辐射（X射线等）烷化剂亚硝酸等某些强烈理化因子引起点突变DNA的大损伤（macrolesion）第三十二页，共一百零一页，2022年，8月28日DNA的大损伤（macrolesion）染色体畸变缺失（deletion）重复（duplication）插入（insertion）易位（translocation）倒位（inversion）染色体结构上染色体数目的变化第三十三页，共一百零一页，2022年，8月28日2.自发突变（spontaneousmutation）

自发突变（spontaneousmutation）是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。第三十四页，共一百零一页，2022年，8月28日自发突变的原因（1）背景辐射和环境因素（3）DNA复制过程中碱基配对错误（2）微生物自身有害代谢产物一个1000bp的基因自发突变频率约为10-6例如，过氧化氢等例如，天然的宇宙射线等第三十五页，共一百零一页，2022年，8月28日（六）紫外线对DNA的损伤及其修复嘧啶（敏感性）＞嘌呤紫外线（ultravioletray，U.V.）嘧啶二聚体（TT，TC，CC）和水合物第三十六页，共一百零一页，2022年，8月28日第三十七页，共一百零一页，2022年，8月28日把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。1.光复活作用（photoreactivation，photorestoration）最早是A.Kelner（1949）在Streptomycesgriseus（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。第三十八页，共一百零一页，2022年，8月28日最明显的是在E.coli的实验①对照：8×106个／mLE.coli→100个／mLE.coli②试验：8×106个／mLE.coli→－－－－→2×106个／mLE.coliUVUV360～490nm可见光，30min第三十九页，共一百零一页，2022年，8月28日使二聚体（dimer）重新分解成单体（monomer）带有嘧啶二聚体的DNA分子DNA分子UV照射黑暗下结合光激活酶——光解酶（光裂合酶，photolyase）复合物300～500nm可见光获得光能而激活释放光解酶第四十页，共一百零一页，2022年，8月28日在一般的微生物中都存在光复活作用，在利用UV进行诱变育种等工作时，应在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。注意第四十一页，共一百零一页，2022年，8月28日2.切除作用（excisionrepair）是活细胞内一种用于修复被UV等诱变剂（包括烷化剂、X射线和γ射线等）损伤后DNA的修复方式之一，又称暗修复（darkrepair），通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。第四十二页，共一百零一页，2022年，8月28日酶切合成切开切除聚合连接第四十三页，共一百零一页，2022年，8月28日二、突变与育种

（一）自发突变与育种

（breedingbyspontaneousmutation）

1.从生产中育种在生产第一线易获得较优良的生产菌株。第四十四页，共一百零一页，2022年，8月28日2.定向培育优良菌株定向培育是一种利用微生物自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。第四十五页，共一百零一页，2022年，8月28日（二）诱变育种（breedingbyinducedmutation）

诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。第四十六页，共一百零一页，2022年，8月28日筛选诱变诱变育种定向的——更重要随机的第四十七页，共一百零一页，2022年，8月28日可获得供工业和实验室应用的各种菌株；提高有用代谢产物的产量；减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。诱变育种具有重大的实践意义第四十八页，共一百零一页，2022年，8月28日诱变育种的特点（1）提高突变率，扩大突变谱（2）有效地改良个别、单一性状（3）缩短育种年限（4）定向变异和有益突变的频率低第四十九页，共一百零一页，2022年，8月28日出发菌株纯化、同步培养培养液离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤细胞或孢子悬液诱变处理平板分离初筛复筛保藏及扩大试验活菌计数，诱变预备试验存活细胞计数，致死率计算变异率计算1.诱变育种的基本过程第五十页，共一百零一页，2022年，8月28日2.诱变育种中的原则

（1）选择简便有效的诱变剂诱变剂（mutagen）物理因素化学诱变剂非电离辐射类的紫外线、激光和离子束（ionbeam，有小型加速器提供）等引起电离辐射的X射线、γ射线和快中子等主要有烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物第五十一页，共一百零一页，2022年，8月28日

烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接发生反应，更易引起基因突变。最常用的烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亚硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。第五十二页，共一百零一页，2022年，8月28日拟辐射物质氮芥、硫芥和环氧乙烷等各种点突变一般只有辐射才能诱发的染色体畸变诱发第五十三页，共一百零一页，2022年，8月28日

出发菌株（originalstrain）是指用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。（2）挑选优良的出发菌株第五十四页，共一百零一页，2022年，8月28日合适的出发菌株来源：①由自然界直接分离获得的野生型菌株；②在生产中经历生产条件考验的菌株；③已经过诱变甚至多次改造的菌株；④选用对诱变剂敏感性较高增变变异株；等等。第五十五页，共一百零一页，2022年，8月28日在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的悬液状态。（3）处理单细胞或单孢子悬液菌悬液制备目的在于提高诱变处理的效果因为:一方面，分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，另一方面，又可避免长出不纯菌落。第五十六页，共一百零一页，2022年，8月28日诱变剂的作用有三条：一是提高诱变的频率二是扩大变异的幅度三是使变异向正变的方向移动（产量提高）（4）选用最适的诱变剂量第五十七页，共一百零一页，2022年，8月28日诱变剂的复合处理常常表现出明显的协同效应，这对育种工作是有利的。（5）充分利用复合处理的协同效应（synergism）第五十八页，共一百零一页，2022年，8月28日第五十九页，共一百零一页，2022年，8月28日复合处理有几类：①两种或多种诱变剂的先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。第六十页，共一百零一页，2022年，8月28日为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，并找到形态变异与产量变异两者间的相关性。（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标第六十一页，共一百零一页，2022年，8月28日利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为可见的“形态”性状。快速平板检出法第六十二页，共一百零一页，2022年，8月28日在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶变色圈（用碘液使淀粉显色）的大小，氨基酸显色圈（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小，柠檬酸变色圈（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生长圈的大小（测定生长因子产生），纤维素酶对纤维素水解圈（用刚果红染色）的大小，外毒素的沉淀反应圈的大小等，均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的“形态”指标。第六十三页，共一百零一页，2022年，8月28日（7）设计高效筛选方案设计简便、高效的科学筛选方案。初筛筛选工作复筛以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）第六十四页，共一百零一页，2022年，8月28日常用的筛选方案第一轮：第二轮：第三轮： 同第二轮第四轮： 同上

... 直至获得较满意的结果为止第六十五页，共一百零一页，2022年，8月28日初筛复筛对产量突变株生产性能的测定方法粗测为主在培养皿平板上在摇瓶中（8）创造新型筛选方法较精确的测定摇瓶培养or台式自控发酵罐培养第六十六页，共一百零一页，2022年，8月28日3.3类突变株的筛选方法

（1）产量突变株的筛选1971年，国外有人报道了筛选春日霉素（kasugamycin，即“春雷霉素”）生产菌时所采用的一种琼脂块培养法，一年内曾使该抗生素产量提高10倍。第六十七页，共一百零一页，2022年，8月28日此法的关键是用打孔器取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。数据精确，效率高第六十八页，共一百零一页，2022年，8月28日（2）抗药性突变株的筛选基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。特点：正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）第六十九页，共一百零一页，2022年，8月28日梯度平板法（gradientplate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。第七十页，共一百零一页，2022年，8月28日梯度平板法（gradientplate）是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。第七十一页，共一百零一页，2022年，8月28日表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”。strrstrs对链霉素的抗性敏感性第七十二页，共一百零一页，2022年，8月28日（3）营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株（auxotrophicmutant）在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。第七十三页，共一百零一页，2022年，8月28日a.基本培养基（MM，符号为［－］）①

与筛选营养缺陷型突变株有关的3类培养基仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称MM。第七十四页，共一百零一页，2022年，8月28日b.完全培养基（completemedium，CM，符号为［＋］）凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为CM。一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。第七十五页，共一百零一页，2022年，8月28日c.补充培养基（supplementalmedium，SM，符号为［A］或［B］等）凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为SM。在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。第七十六页，共一百零一页，2022年，8月28日原养型（prototroph）②

与营养缺陷型突变有关的3类遗传型个体野生型（wildtype，wildstrain）营养缺陷型（auxotroph）从自然界分离到的原始菌株（A＋B＋）经诱变剂处理后的突变株（A—B—）经回复突变或重组后产生的菌株（A＋B＋）第七十七页，共一百零一页，2022年，8月28日③

营养缺陷型的筛选方法第一步，诱变剂处理第二步，淘汰野生型第三步，检出缺陷型第四步，鉴定缺陷型第七十八页，共一百零一页，2022年，8月28日淘汰野生型的方法（1）抗菌素法青霉素制霉菌素（2）菌丝过滤法第七十九页，共一百零一页，2022年，8月28日第三步，检出缺陷型对照培养法夹层培养法（layerplatingmethod）限量补充培养法逐个检出法影印平板法第八十页，共一百零一页，2022年，8月28日①对照培养法CMMMSM②夹层培养法MMCMMM＋菌液第八十一页，共一百零一页，2022年，8月28日③影印法CMMM④限量补充培养法⑤逐个检出法第八十二页，共一百零一页，2022年，8月28日第四步，鉴定缺陷型借助生长谱法（auxanography）进行。第八十三页，共一百零一页，2022年，8月28日营养缺陷型的鉴定－生长谱法营养组合编号组合营养因子A1,2,3,4,5B2,6,7,8,9C3,7,10,11,12D4,8,11,13,14E5,9,12,14,15第八十四页，共一百零一页，2022年，8月28日ABECD缺13ECDBA缺2ABECD单独A或B均不能满足BECDA缺1浓度太大第八十五页，共一百零一页，2022年，8月28日第八十六页，共一百零一页，2022年，8月28日1.营养缺陷型（auxotroph）

某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型。第八十七页，共一百零一页，2022年，8月28日营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中——十分重要表型判断的标准：在基本培养基上能否生长第八十八页，共一百零一页，2022年，8月28日营养缺陷型的表示方法：基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC第八十九页，共一百零一页，2022年，8月28日hisC－缺陷型hisC＋野生型第九十页，共一百零一页，2022年，8月28日2.抗性突变型（resistantmutant）指野生型菌株因发生基因突变，使菌株对对某化学药物或致死物理因子，特别是抗生素，产生抗性的抗性变异类型